山西产酸枣仁药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱及聚类分析.doc

山西产酸枣仁药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱及聚类分析【摘要】目的 建立山西产酸枣仁药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱并进行聚类分析,为科学评价和有效控制其质量提供可靠的方法。方法 采用HPLC-DAD-ELSD串联技术,建立12批山西不同产地的酸枣仁药材中黄酮类和皂苷类化合物指纹图谱共有模式,并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行数据处理,以共有峰与对照峰的比值进行聚类分析。结果 该方法对酸枣仁药材中黄酮类、皂苷类成分均有良好的分离,一次进样同时测定了两类不同成分的指纹图谱。结论 该指纹图谱研究及聚类分析方法可用于控制酸枣仁药材质量。 【关键词】 酸枣仁;高效液相色谱-二极管阵列-蒸发光散射检测法;指纹图谱;聚类分析Abstract：Objective To establish the HPLC-DAD-ELSD fingerprint and effective quality control of Semen Ziziphi Spinosae from Shanxi province. Methods HPLC-DAD-ELSD series technique was used, and the mutual model was established depending on twelve Semen Ziziphi Spinosae samples from different growing areas in Shanxi. The software Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Chinese Material Medical was applied to analyze. Samples was clustered using principal component analysis based on the ratio of characteristic peaks and standard peak. Results The established method is good for the separation of flavonoids and saponins from Semen Ziziphi Spinosae, and simultaneous determination of the two different components in one sample injection. Conclusion The method is workable to control the quality of Semen Ziziphi Spinosae.Key words：Semen Ziziphi Spinosae;HPLC-DAD-ELSD;fingerprint;hierarchical cluster analysis酸枣仁为鼠李科枣属植物酸枣的干燥成熟种子,其味酸,性平,具有补肝宁心、镇静安神、敛汗、生津功效。现代药理研究表明,酸枣仁中皂苷类和黄酮类是其镇静催眠的主要有效成分1。山西省自古以来就是酸枣仁的主产区之一2。目前对其他省区酸枣仁的高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)和高效液相色谱-紫外分光光度法(HPLC-UV)指纹图谱研究已有文献报道3-4,而针对山西产酸枣仁的指纹图谱研究还未见报道。本研究将HPLC-DAD-ELSD联用技术用于酸枣仁中黄酮类和皂苷类成分的测定,并对12批山西产酸枣仁药材的指纹图谱进行聚类分析,以期为酸枣仁药材及含有酸枣仁的中药制剂的质量控制提供有效方法,为企业遴选并固定酸枣仁药材的产地提供依据。1 仪器与试药Waters 2695 Alliance系统,四元泵,真空在线脱气,自动进样器,Waters 2998二极管阵列检测器,Empower工作站;Alltech 2000ES蒸发光散射检测器(美国奥泰公司);十万分之一天平(梅特勒公司);EL204万分之一天平(上海精密仪器有限公司)。乙腈为色谱纯,DikmaPure,Dima technology INC,美国;水为乐百氏纯净水;其余试剂均为分析纯。酸枣仁皂苷A(批号110734-200509)、酸枣仁皂苷B对照品(批号110814-200607)均购于中国药品生物制品检定所;斯皮诺素(批号E-0391,纯度98%)、白桦脂酸(批号09120822,纯度98%)均购于上海同田生物有限公司;酸枣仁药材(2009年10月份选取卵圆形酸枣,产地详见表1)经山西中医学院中药系裴香萍讲师鉴定。样品预处理：对所采的酸枣仁分别除去果肉和角质层,60 干燥8 h,粉碎,过40目筛,得酸枣仁粉末。表1 药材样品来源2 方法与结果2.1 酸枣仁药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱方法的建立2.1.1 色谱条件采用Grace Brava C18-BDS(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱。流动相为A(乙腈)-B(水);梯度洗脱：010 min, 12%19%A;1020 min,19%23%A;2030 min,23%35%A;3040 min,35%45%A;4050 min,45%-100%A;5060 min, 100%12%A;6070 min,12%A。检测波长：335 nm;柱温：25 ;流速：1.0 mL/min;进样量：10 μL。ELSD参数：漂移管温度100 ,载气流速2.9 L/min。其中黄酮类成分采用HPLC-DAD法测定;皂苷类成分采用HPLC-ELSD法测定。在上述色谱条件下,各色谱峰分离良好,见图1、图2。AB注：A.指纹图谱;B.叠加图;S.斯皮诺素图1 12批山西产酸枣仁药材黄酮类成分指纹图谱及叠加图AB注：A.指纹图谱;B.叠加图;S.酸枣仁皂苷脂酸图2 12批山西产酸枣仁药材皂苷类成分指纹图谱及叠加图2.1.2 对照品溶液的制备取斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、白桦脂酸对照品适量,精密称定,分别置5 mL容量瓶中,用70%乙醇定容至刻度,摇匀,配制成含斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、白桦脂酸分别为1 188、990、407、621.6 μg/mL的混合对照品溶液。2.1.3 供试品溶液的制备取酸枣仁粉末约1 g,精密称定,置索氏提取器中,加石油醚(6090 )90 mL,加热回流4 h,弃去石油醚液,药渣挥去溶剂后转移入圆底烧瓶中,加入70%乙醇40 mL,回流提取3 h,滤过,药渣用70%乙醇5 mL洗涤,合并洗液和滤液,回收溶剂至干,残渣加70%乙醇溶解并转移至2 mL量瓶中,加70%乙醇至刻度,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。2.2 干扰试验进样供试品溶液10 μL,记录120 min的色谱图,发现70 min后无色谱峰。因此分析时间定为70 min。吸取甲醇溶液10 μL,进样,运行70 min,没有发现影响指纹图谱共有峰的溶剂峰。2.3 方法学考察2.3.1 精密度试验精密吸取酸枣仁2号样品溶液10 μL,连续进样5次,记录色谱峰保留时间和峰面积。结果表明,在同一台仪器测得黄酮类色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度大于0.98(中位数),皂苷类的色谱指纹图谱与其共有模式指纹图谱的相似度大于0.99(中位数),均符合指纹图谱的要求。2.3.2 稳定性试验精密吸取酸枣仁12号样品溶液10 μL,分别在0、2、8、10、16、36 h连续测定6次,对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明,在同一台仪器测得的黄酮类的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度大于0.97(中位数),符合指纹图谱的要求。皂苷类的色谱指纹图谱与其共有模式指纹图谱的相似度大于0.99(中位数),表明在36 h内供试品溶液的稳定性良好。2.3.3 重复性试验取酸枣仁12号样品粉末5份,按供试品制备方法制备,分别进样,考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明,在同一台仪器测得黄酮类的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度大于0.97(中位数),皂苷类的相似度大于 0.99(中位数),均符合指纹图谱的要求。2.4 共有峰的标定根据12批山西产酸枣仁药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱,分别标定共有峰黄酮类12个、皂苷类10个。2.5 相似度的计算采用国家药典委员会出版的中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)进行相似度计算。设置样品1图谱为参照谱,多点校正,自动匹配,生成对照指纹图谱。结果见表2。表2 山西产酸枣仁药材黄酮类成分和皂苷类成分指纹图谱相似度2.6 山西产酸枣仁药材的指纹图谱聚类分析将12批酸枣仁药材的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱中黄酮类12个共有峰与参照峰(S)的比值组成12×12阶原始数据矩阵,皂苷类10个共有峰与参照峰(S)的比值组成12×10阶原始数据矩阵,分别运用SPSS18.0对其进行系统聚类分析。采用组间联接法,利用夹角余弦作为样品的测度。分析结果表明,以黄酮类成分为指标,12个样品多数可以聚为2类,其中3、6、7号产地样品的位置较远,可以成为一类,其余成为一类,该结果与指纹图谱的相似度分析结果相似;以皂苷类成分为指标,聚类分析将12个产地的酸枣仁分为2类,其中1、7、12号聚为一类,其余产地为一类,该结果与指纹图谱的相似度分析结果相似。聚类谱系图见图3、图4。图3 黄酮类成分指纹图谱聚类图图4 皂苷类成分指纹图谱聚类图3 讨论由于酸枣仁中的皂苷类成分在紫外区没有或只有弱的紫外吸收,采用紫外检测器同时分析多种皂苷成分时常用到梯度洗脱,且UV低波长检测在梯度洗脱时会出现基线漂移,选择ELSD测定皂苷类成分,可以避免上述问题。而黄酮类成分在紫外检测器上有强响应,所以采用DAD检测器检测。采用HPLC- DAD-ELSD法同时测定皂苷类和黄酮类成分,可以一举两得,节约时间和试验成本。本试验首次对山西产酸枣仁药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱进行了相似度计算和聚类分析。从分析结果还可以看出,黄酮类成分的相似度较高,除3号阳泉市、6号昔阳县、7号五台县的相似度大于0.8,其余均大于0.9;皂苷类成分的相似度较低,除1号左权县、7号五台县、12号介休市外均符合相似度大于0.9的要求,分析原因可能与其生长环境有关。使用HPLC-DAD-ELSD串联技术建立山西产酸枣仁的指纹图谱,能很好地反映并控制其药材质量,这对完善山西野生酸枣仁产地的适宜区划有指导作用。【参考文献】 1 胡熙明,张文康,朱庆生,等.中华本草M.上海：上海科学技术出版社