southern印迹杂交基本方法及主要步骤.doc

基本概念及原理Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量12。基本方法及主要步骤Southern印迹杂交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印迹杂交为例。（1）植物基因组DNA提取；（2）DNA的限制性内切酶酶解、电泳和Southern转移；（3）探针的标记和纯化；（4）杂交、洗膜、检测以及去除膜上探针。主要操作步骤：1琼脂糖电泳（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5g即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要1020g；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要3050g。（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。2印迹转移（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。 Southern印迹杂交转膜示意图（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。变性缓冲液：1.5mol/L Nacl 0.5 mol/L NaOH（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30 min。（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。（6）虹吸转移12-16h。转膜液： 1.0mol/L Nacl 0.4 mol/L NaOH3固定DNA碱性转移不需要固定，在中性缓冲液中室温15分钟。(1.0mol/L Nacl 0.5 mol/L Tris-Cl 1)（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。（3）将膜夹在两张干燥滤纸间，80烘烤1-2h。4预杂交（1）将膜浸入5SSC 中2min，将膜放入干净的塑料袋中。（2）将预杂交液事先在65 预热，然后将10 ml 预杂交液加入袋中，封口。（3）65预杂交1h 以上，不时摇动。5杂交（1）取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml杂交液及5l 变性探针，排除气泡后封口。（2）将杂交袋放入65 水中杂交过夜。6按下列条件洗膜（1） 剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20mL的2SSC 0.1% SDS溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次5分钟。（2.）用镊子将膜转入0.1SSC，0.1% SDS溶液(先放50水浴预热)中，50水浴振荡洗涤两次，每次15分钟。 （3）用镊子将膜取出转入装有20mL洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5分钟。 7信号检测 （）所需试剂： 请按下表组分准备所需试剂。溶液 组分/制备 洗涤缓冲液 0.1M顺丁烯二酸, 0.15M NaCl; pH7.5(20 C); 0.3% (v/v) Tween-20 顺丁烯二酸缓冲液 0.1M顺丁烯二酸, 0.15M NaCl;用NaOH调节到pH 7.5(20C) 检测缓冲液 0.1M Tris-HCl,0.1M NaCl,pH 9.5 (20 C) TE-缓冲液 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 （）制备试剂盒工作液 溶液 组分/制备 阻断液 用顺丁烯二酸缓冲液1:10稀释10阻断液，制备成1工作液。 抗体溶液 每次使用前，需10,000 rpm离心抗Dig-AP酶结合物5分钟，从表面小心吸取所需的量。用阻断液按1:5000稀释抗体。 显色底物液 加200ul NBT/BCIP到10 ml检测缓冲液中。 （）流程：在培养皿上进行信号检测。 注意: 所有孵育过程应在15-25C下搅动进行，如果膜要用于再杂交，则不要让膜在任何时候变干。 步骤 操 作 1 在杂交和严谨洗涤后，在洗涤缓冲液中浸润1-5分钟。 2 在30ml阻断液中孵育30分钟。 3 在10ml抗体液中孵育30分钟。 4 用30ml洗涤液洗涤2x15分钟。 5 在15ml检测缓冲液中平衡2-5分钟。 6 在避光条件下，于10ml新鲜制备的显色底物液中反应显色。在显色过程中勿摇