鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定1 - 副本.doc

鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定一、实验目的 1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作3 掌握SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的原理及操作二、实验原理盐析法1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重要方法之一。许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现 象称为“盐溶”（Salting in）。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐 析“（Salting out）。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法:常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate）破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共价键，使蛋白质变性而改变原来的空间构象，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS结合从而形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。使蛋白质的电泳迁移率仅仅取决于分子大小这一因素。当蛋白质的分子量在11，700165，000之间时，电泳迁移率与分子量对数呈直线关系，符合直线方程式：LgMw= bx + k式中：Mw为蛋白质分子量，X为电泳迁移率，k和b均为常数。利用这一关系将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶作为支持电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N甲叉双丙烯酰胺聚合而成。在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其孔隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的孔隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶。连续体系；不连续体系 前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein (1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。三、实验步骤鸡蛋去蛋黄蛋清均匀搅拌蛋清液蛋清液盐酸调ph至5.5,70处理15分钟。热变性沉淀杂蛋白离心，去沉淀，去除碱性杂蛋白NaOH调ph8.0-8.5，加饱和硫酸铵，至饱和度为10%。较纯的碱性蛋白质沉淀。冰浴30min，离心去上清。较纯的碱性蛋白在Eppendorf管中加适量沉淀，用200ulddH2O沉淀，溶液加入20ulTCA，沉淀蛋白颠倒3次，13000rpm离心10min取沉淀加200ul丙酮，颠倒三次，13000rpm离心10min，洗去TCA取沉淀丙酮挥发干净，加入适量loading buffer（增加样品比重）和ddH2O，水浴15min准备电泳 3.1 蛋清准备取1枚鲜鸡蛋，洗净擦干，在小头用镊子轻轻捣一直径为4mm的小孔，下用烧杯或量筒接好，再在大头打一细小针孔进气，此时蛋清缓缓自动流出。取蛋清的操作应很细致，避免蛋黄破裂混入蛋清而影响实验结果。将所得鸡蛋清充分打匀（约15分钟）。打时力戒过猛以防止产生泡沫变性作用。然后用4层纱布滤去杂质，测量体积（或体重），记录pH值。3.2 热变性取稀盐酸调节鸡蛋清pH值 5.5左右（4-7）、70处理15分钟。离心，去沉淀，保留上清。3.3 分步盐析取适量上清，先用1N的氢氧化钠后用0.1N NaOH溶液调至pH 8.08.5，加60乙醇溶液至饱和度为10%。冰浴放置30min。离心，弃上清。（比例：800ul到eppendorf管中，加入88.9ul饱和硫酸铵）。3.4 样品处理取适量沉淀到干净的eppendorf管内，加200ul ddH2O溶解沉淀。加入20ulTCA，颠倒三次，13000rpm离心10min。弃上清。Eppendorf管中加入200ul 丙酮，颠倒三次，13000rpm离心10min。弃上清。待管内残留丙酮挥发干净，加入适量loading buffer及ddH2O，沸水浴处理15min，待电泳鉴定。3.5 电泳鉴定上述样品用浓度12%的SDS-PAGE分析。注意加入标准对照3.6 结果观察染色，脱色，观察实验结果四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作：1 实验材料和试剂（1）丙烯酰胺和N, N-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。（2）十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液保存于室温。（3）用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。（4）TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。（5）过硫酸铵。 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须新鲜配制。（6）1.5M Tris，pH8.8（分离胶缓冲液）（7）1M Tris，pH6.8（浓缩胶缓冲液）（8）Tris-甘氨酸电泳缓冲液。25mM Tris，250mM 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS，（9）样品处理液，50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油（10）染色液：0.1% 考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇，10% 冰醋酸（11）脱色液：10% 甲醇，10% 冰醋酸2 实验步骤1. 配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂2SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 根据厂家说明书安装玻璃板。 确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约23mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。 分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100加热3分钟以使蛋白质变性。 浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 按予定顺序加样，加样量通常为1025l（1.5mm厚的胶）。 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。3用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色12小时或过夜。4. 换脱色液脱色，需310小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。此方法检测灵敏度为0.21.0 ug。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。五、实验结果与思考题：结果分析：实验失败。原因： 乙醇不能作为盐析沉淀介质 PH过大，蛋白变性1 、分析盐析法制备溶菌酶的优缺点及改进方法 答：由于溶酶菌比较稳定 ，分子量、等电点等与蛋清中其他蛋白质有较大差异。因此可以利用常规方法的科学组合分离得到纯度较高、活性较强的溶菌酶。改研究采用调节ph和硫酸铵分段盐析法两步组合，从鸡蛋清中提取溶菌酶，方法简单易行，成本低廉、分离周期短、溶菌酶纯度高、是一种易于推广和产业化的有效方法。但所制得的溶菌酶过程中易因为各种原因死亡。2 、查阅文献，设计溶菌酶结