凝集素的分离纯化、基因克隆.doc

第16卷第2期2003年6月山 东 科 学SHANDONG SCIENCEVo116 N o2Jun2003文章编号：1002-40262003)02-0011-07凝集素的分离纯化、基因克隆及功能研究进展张成省 ，李多川 ，孔凡玉*综述*(1中国农业科学院烟草研究所，山东青州262500；2山东农业大学植保学院，山东泰安271018)摘要：凝集素(1ectin)研究近年来发展迅速，尤其在植物基因工程中，植物外源凝集素基因越来越受到重视。本文从凝集素的分离纯化、基因克隆、理化性质和功能等方面进行了综述。此外还讨论了凝集素基因在植物基因工程中的应用。关键词：凝集素；功能；分离纯化；基因克隆中图分类号：$4321 文献标识码：A凝集素是一类专一识别糖并与之非共价地、可逆地结合的蛋白质或糖蛋白。这种蛋白质或糖蛋白本身具有特定的生物学功能，它们能与动物、植物、微生物细胞发生特异的作用，诱发一定的生理效应。近年来，凝集素研究方兴未艾，在理化性质、分离纯化、基因克隆和功能等领域取得了有意义的进展。1 凝集素的分布和功能凝集素广泛分布于植物、动物和微生物中。目前已有i000多种植物被报道含有凝集素l1，它们在植物根、茎、叶、花、果实、种子、汁液中广泛分布。自Ashwell和Morell发现肝细胞凝集素 以来，人们在高等动物体内陆续发现了多样的凝集素，大量分布在血清、卵、淋巴细胞、精子等不同部位。已发现的微生物凝集素一般分布在体表，胞质中少见。PseudomoTlas凸eruginosa是原核生物中仅知的分布于胞质内的凝集素_3。凝集素在生物界的广泛分布及其在生物体内的丰富程度本身就说明其在生物体内的地位十分重要。凝集素的功能似乎与其来源有关系，即凝集素在不同生物及同一生物不同组织中的分布的多样性决定了其在进化过程中适应并产生了许多独特的功能。11 动物凝集素收稿日期：20030225基金项目：国家自然科学基金(39700097)和国际合作基金(C28011，C28Ol-2F)资助作者简介：张成省(1976一)，男，硕士，从事植物病理学研究。维普资讯 12 山东科学动物凝集素包括C型和S型，分别以膜整合或水溶性的形式存在，通过与体液中的糖配体(如某些激素、细胞因子、生长调节因子等)或细胞表面的糖配体相互作用，进行识别与结合来对细胞产生信号作用，引发细胞产生一系列反应，来参与动物体的发育、内环境的稳定以及机体防御等功能。如哺乳动物肝细胞表面识别半乳糖与鸟类肝细胞表面识别N一乙酰氨基葡萄糖的凝集素分别介导一定糖链结构的血浆糖蛋白内吞来维持内环境的稳定。小鼠精子表面的识别a-Gal基的凝集素4与卵透明带2P3糖蛋白O连接寡糖链的特异性识别与结合发出生物信号，启动一整套发育过程。据近报道，动物体内凝集素还有抗菌5、凝集肿瘤细胞6等防御作用。通常动物凝集素在体内的分布不同，如青蛙的皮肤、卵、肝等组织的凝集素，往往识别的糖基也不相同，在体内的作用亦不同7。12 植物凝集素植物凝集素亦藉其对糖基特异的识别和可逆结合的特点，在体内具重要的生理作用。除了某些酶(几丁质酶、葡糖酶、葡糖苷酶)，凝集素是唯一能够识别和结合微生物或暴露于昆虫及哺乳动物消化道中的糖复合物的植物蛋白。鉴于微生物和动物体内的糖类的分布，以及凝集素的糖结合活性的广谱性，目前认为植物已成功进化出各种类型的糖结合受体的识别反应分子8。分子生物学、生物化学、细胞学、生理学和进化论的各种证据都暗示凝集素在植物防卫反应中具重要作用。而决定它们抗性的就是它们的糖结合活性，即通过识别并结合人侵者上的糖结构，来参与抵抗植物病原和摄食者的人侵。自然界中植物凝集素介导的防御反应主要以两种方式进行9。一种是直接作用，植物凝集素对无脊椎动物和脊椎动物的毒性效应很显著，所以凝集素的这种保卫性质特别针对植食动物，如核糖体失活蛋白型对高等动物的致死效应从古代就已存在，蓖麻毒蛋白对四纹豆象(Callosobruchus maculatus)和墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)具有很高的毒性等。目前研究较多的是植物凝集素的抗虫研究，其作用机制与凝集素和昆虫的肠内壁的糖缀合物特异结合有关。另一种是植物凝集素对病毒、细菌和真菌的间接作用方式。关于植物凝集素保护植物抵抗病原菌的研究，国外已有一些报道。例如草藤(Vicia cracca)凝集素能抑制土壤中分解其中皮的微生物生长，麦胚凝集素(WGA)对绿色木霉(Trichoderma viride)具有抑制作用。事实上，除核糖体失活蛋白型之外，还没有其它植物凝集素抑制病毒侵染、复制和系统传播的报道，但某些植物凝集素可能具有间接的抗毒活性，例如杀虫凝集素的存在可能阻止或减少昆虫介导的病毒病的传播。植物凝集素的抗细菌活性也是一种间接机制，通过细胞壁糖类或胞外多糖相互作用的机制起作用。马铃薯凝集素在细胞壁中使青枯假单胞菌(Pseudomanas solanasearum)的无毒菌株不能运动。以纯的刺苹果的凝集素为材料在空气一水界面抑制细菌运动的实验中，发现它可以使这些本来可以运动的细菌丧失运动能力。从天麻中分离得到的天麻抗真菌GAFP-1，对一些真菌有明显抗性。需要指出的是凝集素并非植物中唯一的防御相关蛋白，而是协同其它的保护性蛋白(如几丁质酶)一起建立一个高效的防御系统。维普资讯 第2期 张成省等：凝集素的分离纯化、基因克隆及功能研究进展 13植物凝集素的内源功能是充当典型的植物储存蛋白，其功能是作为氮源或硫源。还可以作为一种特异性识别因子与其它有机体中的糖复合物相互作用，协调自身与外界的关系。如为建立共生关系，豆科根部凝集素可能参与对根瘤菌和布氏根癌(Bradyrhizobium)的识别和或结合过程。因此，植物凝集素的功能应该是多价的。13 微生物凝集素从1908年，Gugot从大肠杆菌(Escherchia coli)中找到了能凝集血细胞的凝集素至今，已发现了208种微生物凝集素，其中以细菌凝集素为最多，达到了132个，其次为真菌凝集素为57个。目前发现的微生物凝集素大多通过其壁上凝集素对糖基的识别而实现对宿主的感染，所以它们往往在吸附事件中发挥着重要作用。如不具有细胞壁凝集素的细菌突变株失去致病力10。细菌凝集素的抑制剂可以降低细菌的侵染几率。类似的，真菌和病毒的凝集素也与糖复合物结合有关。流感病毒可以与末端是唾液酸的受体结合，用唾液酸酶来处理受体细胞可以使其对流感产生抗性。同时，一些细菌的凝集素参与吞噬作用，这具有重要的临床价值和研究意义。包括Ecoli等肠杆菌在内的I型菌毛与各种动物及人的细胞(如巨噬细胞)表面上的甘露糖受体结合。多数病原性Ecoli还有P和S菌毛。它们很少或根本不结合到人的粒性细胞上，但经其他方式凝集一些动物血细胞。淋病奈瑟氏球菌(Neisser gonorrhoeae)的外膜蛋白被认为是凝集素样成分，它可与吞噬细胞相互反应。而该菌表面上的唾液酸化的脂寡糖则参与对抗吞噬细胞。近年来关于微生物凝集素还具有贮存蛋白的功能也有报道，这些凝集素多分布在微生物体的胞质内。如Arthrobotrys oligospora胞质内的凝集素(AOI )具有氮源的作用，主要表现在：AOL的水平受代谢及生长的调控；处于高氮时，AOI 可以大量积累，而处于氮饥饿时，AOI 较其它蛋白下降很多 。RSI (Rhizoctonia solani lectin)也具有类似的功能。2 凝集素的分离纯化目前，人们已分离纯化的凝集素逾1000种，它们大多为植物凝集素，其中仅豆科植凝集素即达600余种。通过分离纯化人们可以对凝集素的理化性质、蛋白结构与功能及编码的基因作进一步的研究。目前已纯化的凝集素的分子量一般为10100kDa，如最常见的伴刀豆球蛋白A分子量为104kDa，但小麦胚凝集素分子量仅为36kDa。通常凝集素由亚基组成，一般为2个或4个，3个的少见。亚基产生的分子机制有三种解释：不同亚基是不同基因编码的产物；不同亚基由同一基因编码，翻译后裂解成分子量相同或不同的肽链；翻译后发生不同程度的修饰。大多数凝集素的前体分子都比成熟分子大，翻译后经过裂解、糖基化或其它加工后成为成熟分子。凝集素不同，化学组分也是不同的，有的是简单的蛋白质，有的则为糖蛋白。不同的凝集素分子还具有特定的氨基酸组分。同时，通过研究发现凝集素的糖结合位点也是各异的，不同的凝集素分子识别复杂碳水化合物上的维普资讯 14 山东科学特定糖残基，与糖发生可逆结合而不改变糖苷键的共价结构。虽然它们的糖结合活性各不相同，但它们的可结合的糖基类型大体可分为以下6类：(1) 甘露糖(葡萄糖)；(2)N一乙酰氨基葡萄糖；(3) 半乳糖；(4)N一乙酰氨基半乳糖；(5)I，岩藻糖和(6)唾液酸。表1列出了部分已经分离纯化到的凝集素及其性质。表1 部分已纯化的凝集素及其特性3 凝集素基因的克隆1982年Hoffman等克隆了第一个凝集素基因，它编码一个菜豆凝集素蛋白，现在已克隆了大量的凝集素基因，仅植物凝集素基因就达222个，它们大多编码豆科凝集素和单子叶植物甘露糖结合凝集素家族成员。通过对已克隆的凝集素基因的序列分析人们获得了凝集素在分类上更为详尽的信息。已经进一步证实对凝集素家族的分类是合理的 这些家族的凝集素基因具有高度的序列同源性。比如在蛋白质测序和血清学比较基础上将豆科凝集素归为一类凝集素家族。对4O多种豆科凝集素基因序列分析表明它们具高度I维普资讯 第2期 张成省等：凝集素的分离纯化、基因克隆及功能研究进展 15的序列同源性。豌豆凝集素在一65bp处有TATA 框，在该框与起始密码子之间有22bp的重复区域(TAYAAAG和TGCA各两次)】 。刘春明等对豌豆凝集素基因进行克隆及序列分析，与报道的已知序列相比，其核苷酸序列与推测的序列的同源率分别为996 和989 。不仅豆科植物凝集素，Hevein和壳多糖结构凝集素、单子叶植物甘露糖结合凝集素家族、2型核糖体蛋白凝集素超家族的编码基因各具有高度的相关性 同样通过对凝集素基因的序列分析，有可能从基因水平上揭示凝集素功能的作用机制。比如豌豆种子中PSL基因由于有对碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)高度亲和力的启动子，从而解释了豌豆根或植株其它部位的凝集素的量在整个生命循环过程中达微克数量级 。人们已得到在体外具抗真菌活性的凝集素基因，凝集素抗虫基因更是已应用于基因工程。其中，雪花莲外源凝集素(GNA)在体外或转基因抗虫实验中，已证实对某些咀嚼式和刺吸式口器昆虫均有抗性，如烟草夜蛾、豌豆象、飞虱和蚜虫】 ，但对高等动物没有毒性。Hilder等利用CaMV35s启动子和GNA基因的嵌合基因转化烟草，该转基因植物能抑制蚜虫的虫口密度约50 ，且蚜虫的大小、体重、繁殖率明显下降；水稻和蓖麻凝集素也具有相同的杀虫效果。凝集素已被认为目前最有可能取代传统生物制剂如Bt的杀虫蛋白，它不仅有更广的杀虫谱(对同翅目昆虫也有效)，而且较Bt更难产生抗性。利用植物凝集素基因抗虫研究需要关注的是凝集素作为高等动物(包括人)及非目标害虫的抗营养成分(antinutrient property)。来自大豆、腰豆等凝集素对许多动物是有毒性的。凝集素可结合并胞吞进小肠上皮细胞。研究表明GNA及来自蚕豆的凝集素特异结合甘露糖的成分，对小鼠有轻微的影响；此外，GNA的抗虫效果是已知凝集素中效果最好的。所以它较适合用于转基因抗虫研究。在植物中表达凝集素要求相对较高的水平才具有较好的抗虫效果，要求构建强的高效表达载体。此外非常值得关注的是通过凝集素基因扩大根瘤菌宿主范围的可能性研究。生物固氮是一个极富有挑战性也极具吸引力的生物工程，豆科植物以及其它的一些固氮植物引起了人们极大的兴趣，豆科植物根的凝集素是宿主植物对根瘤菌的重要识别因子 。转豌豆凝集素基因的三叶草，在感染豌豆根瘤菌(R1eguminosarum viciae)后结瘤，甚至固氮作用还有提高2。，说明引人豌豆凝集素基因可以去除豌豆根瘤菌对宿主专一性的障碍。与此相似，Hirsh等C21将大豆凝集素基因l el转人百脉根(Lotus)，再用大豆根瘤菌感染百脉根，使其出现结瘤反应，包括根毛卷曲、皮层细胞分裂。Edwards等2。和Hofte等2。 分别将豌豆凝集素转人马铃薯、烟草中，研究了凝集素在转基因植株中的细胞生物学定位及其表达。4 展望凝集素已在许多领域有广泛的应用，在分子结构等方面亦积累了大量资料，可是它的功能一直困绕着人们。如前所述凝集素的功能研究已取得了有意义的进展，凝集素的功维普资讯 16 山东科学能与其多重结合性质是分不开的。在植物和动物中凝集素既可参与自身的调控(内源功能)，也可在与其它生物相互作用中发挥作用(外源功能)，而在微生物中仅仅发现了其参与与侵染寄主有关的作用，在微生物体内的内源功能还少见报道，目前仅有部分真菌凝集素有了这一方面的研究。如果能深入的了解微生物凝集素在微生物体内所扮演的角色，调整和发挥微生物凝集素对人们生产和生活有利的一面，将有利于发掘和利用微生物这一资源宝库以造福人类。通过对凝集素基因的克隆研究发现编码凝集素家族蛋白的基因都互有联系，这些同源基因很可能是由一个先祖基因在复制和分离过程中产生的，这就使不同的蛋白质分子获得了不同的防御性质。这可能意味着一些由凝集素基因调控的事件在同一基因家族甚至不同家族中发挥作用。近年来人们探讨较多的是通过凝集素基因扩大根瘤菌宿主范围的可能性，如果能在这方面取得突破的话，在理论和实践上具有重要意义。随着凝集素研究的逐步深入，它不但在揭开生命活动的奥秘上有重要理论意义，而且在生物学、生物药学以及基因工程等方面必将有更广泛的应用。参考文献：E13 静雨有关植物凝集素的研究进展D国外医学情报，2000，(3)：18192 罗德生凝集素研究进展D医学综述1996，2(3)：119121E33 Garber N，Geumpel U，Belz A，et a1Specificity of the D-galactose-binding lectin of pseudomonasaeruginosa and its strong binding to hydrophobie deribatieves of D-galactose and thiogalactose BiochemJBiophysActa，1992，1116：3313334 -N智小鼠精子表面凝集素受体的细胞化学与生物化学的初步研究口宁夏农学院院报，1994，15(2)：59-635 Suzuki T，Takagi T，Furukokri T，et al，A calcium-depengdent galactose_binding lectin from thetunicate polyandrocarpa misakiensisJJBio1Chem，1990，265(3)：12746 Liener I 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