间质性肺炎病毒上呼吸道感染后病毒载量变化与急性中耳炎的发展.doc

间质性肺炎病毒感染上呼吸道后病毒载量的变化与急性中耳炎的发展张伟 译，鲍诗平 审校Johanna Nokso-Koivisto, et al. VIRAL LOAD AND ACUTE OTITIS MEDIA DEVELOPMENT AFTER HUMAN METAPNEUMOVIRUS UPPER RESPIRATORY TRACT INFECTION. The Pediatric Infectious Disease Journal ,2012,31(7):763-766.摘要：研究上呼吸道感染（URI）中，人类肺间质肺炎病毒（hMPV）在急性中耳炎发病中的作用。对200例URI患儿700例鼻咽分泌物涂片进行评估；其中47例（7%）为hMPV阳性，25例（3.6%）hMPV为hMPV单一病毒。总体上，仅24%感染hMPV 的URI患儿伴发急性中耳炎，与其他呼吸道病毒感染的急性中耳炎发病率相比，发病率最低。发热患儿中hMPV病毒载量显著增高。在hMPV阳性的URI患儿中，伴发急性中耳炎与未伴发急性中耳炎两组患者的病毒载量没有差异。关键词：肺间质肺炎病毒；上呼吸道感染；急性中耳炎；病毒载量人类肺间质肺炎病毒（hMPV），首次发现于2001年1，它是一种呼吸道病毒，属于副粘病毒科，与呼吸道合胞病毒（RSV）同属于肺炎病毒亚科。许多研究表明，世界上几乎所有儿童在5岁前都曾感染过hMPV。综合各年龄组的情况，引起的呼吸道感染症状中，轻者仅出现上呼吸道感染（URI），重者累及下呼吸道27。 因为病毒分离存在困难，分子学检验已经应用于hMPV感染的诊断。但是呼吸道病毒核酸扩增分析敏感性较高，其阳性率临床上遭到质疑。检测相关临床疾病是否存在特异性病毒感染的另一种方式是通过测定病毒载量来确定；有研究表明高hMPV病毒载量和重症下呼吸道感染存在相关性3,8,9。因hMPV种系来源和临床表现上与RSV相似1,5，因此可以推测hMPV同样具有嗜耳性，有引发急性中耳炎（AOM）的趋势。在急性中耳炎期间，鼻咽分泌物涂片、中耳积液病毒检测的阳性率分别为813%11,12和2.3%12。但是hMPV诱发儿童急性中耳炎的机制需要进一步的研究。笔者曾经比较上呼吸道各种病毒感染的中耳炎并发症的发病率10，在该研究中并未提及hMPV等新兴病毒。本次研究的目的在于明确hMPV在上呼吸道感染的中耳炎并发症中的发病机制以及明确hMPV病毒载量是否与上感后急性中耳炎的发病相关。材料和方法我们通过一项前瞻性的横断面研究收集标本和临床数据。该研究的目的旨在调查儿童上呼吸道感染伴发急性中耳炎的发病率和临床特点。研究时间为2003年1月至2007年3月，经当地审查委员会批准，研究由位于德克萨斯州加尔维斯顿的德克萨斯大学医学分校执行。研究方案如前述。简述之，研究对象为6个月到3岁的健康儿童；随访1年内的伴发AOM的URI的发生。当患儿出现URI症状时，由患儿父母通知研究人员。研究医生接诊患儿，并随访其后的4周AOM的发生情况。随访期间，患儿接受耳镜检查、体格检查、声导抗检查。URI伴发AOM，定义为URI出现后28天内发生的AOM。临床表现为：（1）具备急性中耳炎症状（2）鼓膜炎症体征和（3）耳镜或声导抗检查证实存在中耳积液。中耳炎倾向，定义如下：1年内中耳炎发作4次，或6个月内3次，或6岁前6次或第一性中耳炎发作小于6月龄。在URI起病7天内和AOM确诊时采集呼吸道标本。利用鼻拭子进行病毒学培养，利用附粘液池的吸管收集鼻咽部分泌物进行其他病毒学检查（Mucaid，Laboratoires Pharmaceutiques Vygon，couen，France）。标本收集完毕，用1mL磷酸盐缓冲液冲洗吸管和粘液池，以获取尽可能多的标本，记录液体总量以计算原始标本的稀释情况。前期研究包括标准法鼻拭子病毒培养，RSV流行季节同时进行RSV抗原的酶免测定。对病毒培养及酶免测定阴性的标本进行多聚酶链式反应分析（PCR），检测病毒包括呼吸道合胞病毒A、B，副流感病毒13，流感病毒A、B，同时进行实时PCR分析，包括腺病毒、肠道病毒、鼻病毒和冠状病毒的测定（OC43,229E和NL63；美国威斯康星州密尔沃基医学院执行，WI）。具体到本报道，我们对727例鼻咽分泌物标本进行了hMPV的定量PCR分析（qPCR）。利用MagMAX全核酸纯化试剂盒(Ambion/Applied Biosystems, Austin, TX，in Biosprint 96，Qiagen, Valencia, CA)对200uL鼻咽分泌物标本进行核酸提取。完成提取后，用不含核酸的0.1mmol/L乙二胺四乙酸(Ambion/Applied Biosystems,Austin, TX)将核酸提取物以1：1的比例稀释。以40uL反应量型的合成试剂盒(Bio-Rad, Hercules, CA)将提取的RNA转化为互补DNA（cDNA）。通过双重定量PCR检测技术对转化的cDNA进行hMPV和RSV引物靶向扩增13。使用TaqMan(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Integrated DNA Technologies, Coralville, IA )探针对特异性扩增产物进行追踪。每25uL反应液中含12.5uL iO超混合物 (Bio-Rad)，1 uL（5uM）hMPV和hRSV引物，0.5uL（7.5uM）hMPV-6-碳荧光素和RSV-TX红探针，4.5ul无核酸液和3uLcDNA模板。qPCR由CFX实时PCR仪（Bio-Rad）完成。病毒质粒能够吸附在操作时并行产生的PCR靶物上，形成标准曲线，由此得到病毒滴度。鉴于qPCR能够定量分析阳性反应物，双联法能够检测出50%以上已标记标本微达10个拷贝的病毒量，该法为我们提供了较其他报道更为敏感的检测方法。为评价RNA和cDNA的质量，我们对每一例鼻咽分泌物标本进行人3-磷酸-甘油醛脱氢酶14的平行qPCR检测。检测量低于500拷贝提示该标本质量不可靠，在进一步检测中该标本将会被剔除。收集的864例URI标本中，700例标本通过了3-磷酸-甘油醛脱氢酶检测，占总数的81%。根据原始样本的稀释比例和RNA提取、qPCR分析过程的稀释比例，我们可以计算每毫升样本中RNA拷贝数。700例URI样本中有58例因鼻咽分泌物稀释比例不明而无法计算RNA拷贝数。因此，我们共计算出了642例URI鼻咽部分泌物样本的病毒载量。将病毒载量值进行自然对数转化之后，我们采用Mann-Whitney秩和检验将AOM和发热的发生率与病毒载量进行比较分析。结 果参加hMPV研究的200位受试患儿中，49%为女性，59.5%为白种人，28%为黑人，3%为黄种人，9.5%为混血人种；45%为西班牙裔，55%非西班牙后裔。大多数患儿没有参加托管（66%），53%的患儿母乳喂养，31%的患儿有吸烟的暴露史。总体评价，56%的患儿有过中耳炎发作史，7%的患儿有中耳炎倾向。700例URI病例中，经过上述病毒检测结果显示，534例（76%）检测出呼吸道病毒；303例（43%）检测出单一病毒；48例（7%）检测出hMPV；25例（3.6%）检测出专有病毒。其他检测出的呼吸道病毒包括163例（23%）腺病毒，143例（20%）鼻病毒，104例（15%）呼吸道合胞病毒，100例（14%）肠病毒，55例（8%）冠状病毒，43例（6%）副流感病毒和30例（4%）流感病毒。共有45例（23%）患儿在研究期间被确诊为上呼吸道hMPV感染；3例患儿两次hMPV检测均呈阳性。除7月外，全年都有hMPV检出；以1月3月检出率最高。hMPV感染患儿月龄的中位数为17个月，该中位数是其他病毒上呼吸道感染患儿月龄中位数中最小的。与其他患儿相比，单纯hMPV感染的患儿的症状、体征非常相似；hMPV感染的URI患儿出现发热的可能性大，但与其他病毒感染的患儿相比较无显著差异。总体而言，37%的URI患儿伴发有AOM。25例URI患儿鼻炎分泌物标本检测出了hMPV，该群患儿中6例（24%）伴发AOM，与其他病毒感染相比，hMPV伴发AOM的几率较低。hMPV之外的单种病毒感染URI患儿中，AOM发病率最高的是腺病毒（48%），其余依次为冠状病毒（46%），RSV（44%），肠病毒（32%），流感病毒（31%），副流感病毒（27%）和鼻病毒（27%）。消除反应和稀释的影响，经过计算，所有hMPV检测阳性的47例鼻咽分泌物标本中，病毒载量最低者为10拷贝/mL，病毒载量中位数为3.2X107拷贝/mL（平均：9.2X108拷贝/mL；范围：2.7X1041.0X1010拷贝/mL）。21例（45%）hMPV阳性的样本检测出高水平病毒载量（108拷贝/mL）。25例单纯hMPV感染的患儿中， 伴随发热的患儿病毒载量（平均3.3X108拷贝/mL）明显高于不伴随发热的患儿的病毒载量（1.0X106拷贝/mL，P=0.004，图1）。但是比较伴发AOM与不伴发AOM的患儿病毒载量，两者间无显著性差异（P=0.47，图1）。URI期间病毒载量分布，病毒载量与发热、AOM的关系。请见补充表格1，/INF/B137. 根据数据记载，hMPV病毒载量与其他症状、体征无相关性（数据省略）。图1 25例单纯hMPV感染的URI患儿病毒载量与AOM和发热的相关性讨 论本研究首次将hMPV感染的URI和其他病毒感染的URI患儿的AOM发病率进行比较。通过对AOM发病年龄高峰患儿的前瞻性、横断面研究得出研究数据。发现，单种病毒感染的病例中，hMPV感染患儿中AOM发病率仅为24%，与之比较，其他病毒感染患儿中AOM发病率高达27-48%。并且发现，URI期间hMPV病毒载量与AOM发病率无相关性。尽管hMPV与RSV关系密切，但其对临床疾病的影响较小5,15。与RSV相比较，hMPV引起的炎症性疾病较轻，因此可以解释我们上述报道的数据，即hMPV的AOM发病率较低。之前曾有研究者报道，hMPV感染的URI患者伴发AOM的发病率较高，但这些研究中未使用PCR技术对呼吸道病毒谱进行检测；因此存在hMPV和其他病毒共同感染的可能。根据William等7报道，回顾性分析118例hMPV感染的URI病例，AOM发病率达50%；研究者仅对病毒培养阴性的标本进行了hMPV的PCR分析，并没有针对其他种类病毒进行PCR分析；Heikkinen等报道，hMPV感染URI的39例病例中，AOM发生率为41%，其中年龄低于3岁患儿占61%2。该研究仅针对hMPV、鼻病毒和肠病毒进行了PCR分析；hMPV感染之外的病毒的URI病例AOM发病率未见报道。本研究合理性在于采用了恰当的病毒学研究方法，包括PCR分析，呼吸道病毒谱分析，及单种病毒感染URI的AOM发病率的比较，剔除了多种病毒共同感染的复杂干扰因素。分析导致本研究中hMPV-URI的AOM发病率较低另一个因素可能是，我们采用的高度敏感性的qPCR技术，将病毒载量极低和病情较轻的患者列入了hMPV感染的病例。无论何种情况，hMPV在AOM中的发病中发挥了作用；无论是否存在致病菌，在患儿鼻咽部分泌物和中耳积液中均能检测到hMPV12,16。目前，在本研究中URI的hMPV检出率为7%，与之前文献报道的2%20%的数据相符合2-5,8,13,17,18。研究还发现本地区hMPV的发病高峰季节为冬季（1月3月）这与Williams等报道的结果一致7。另一项研究发现，hMPV感染会发生不同年份的变化；第一年研究发现hMPV感染率高达25%。第二年则低至4.7%19。在为期4年的研究中，我们尚未发现感染率存在显著的年份间的变化。研究中还发现，hMPV病毒载量与发热存在显著相关性；这与Martin等报道的结果相一致17。此外还有报道称hMPV高病毒载量与下呼吸道严重并发症密切相关3,8,9。但是本研究并未发现hMPV病毒载量与AOM的相关性。这可能与研究对象数量较少有关，或者病毒载量未能引起咽鼓管功能障碍，因此降低了AOM的发病率。综上所述，本研究中4岁以下URI患儿的hMPV检出率为7%，有3.6%的患儿为单纯hMPV感染。与其他病毒感染相比，hMPV-URI的AOM发病率较低。病毒载量与发热相关，但与AOM的发生及其他症状、体征无关。其他呼吸道病毒导致AOM的发病机制还有待进一步研究。ACKNOWLEDGMENTSThe authors thank Krystal Revai, Ron L Veselenak, Sangeeta Nair, M. Lizette Rangel, Kyralessa B. Ramirez, Syed Ahmad, Michelle Tran, Liliana Najera, Rafael Serna, Carolina Pillion and Ying Xiong for assistance with study subjects and specimen collection and processing. The authors also thank Antonella Casola and Roberto Garofalo for providing hMPV and RSV positive controls. Yimei Han is acknowledged for statistical analyses.参考文献1. van den Hoogen BG, de Jong JC, Groen J, et al. A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease. Nat Med. 2001;7:719724. 2. Heikkinen T, Osterback R, Peltola V, et al. Human metapneumovirus infections in children. Emerging Infect Dis. 2008;14:101106. 3. Sarasini A, Percivalle E, Rovida F, et al. Detection and pathogenicity of human metapneumovirus respiratory infection in pediatric Italian patients during a winterspring season. J Clin Virol. 2006;35:5968. 4. Sloots TP, Mackay IM, Bialasiewicz S, et al. Human metapneumovirus, Australia, 2001-2004. 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