p16和p53抑癌基因产物在胰腺癌中表达的研究.doc

p16和p53抑癌基因产物在胰腺癌中表达的研究肿瘤防治杂志 2000年第2期第17卷 基础与临床研究作者：袁荣文姜汉英薛新波覃修福夏穗生单位：袁荣文姜汉英(湖北省同济医科大学器官移植研究所武汉市430030)；薛新波覃修福夏穗生(湖北省同济医科大学附属同济医院普外科武汉市430030)关键词：胰腺癌；p16；p53；免疫组织化学【摘要】目的：探讨抑癌基因p16和p53在胰腺癌中的表达与临床病理的关系及其在胰腺癌发病机制中所起作用。方法：应用免疫组织化学方法检测50例胰腺癌p16和p53蛋白的表达水平。结果：p16蛋白表达阳性率为48%，组织学级阳性率(80%)显著高于级(50%)和级(25%)；临床期阳性率(80%)显著高于期(38.9%)和+期(29.4%)。p53蛋白表达阳性率为54%，临床期阳性率(26.7%)却显著低于期(61.1%)和+期(70.6%)。p16发生缺失同时伴有p53基因突变，即p16(-)p53(+)共17例，占34%。结论：胰腺癌发生中存在p16抑制途径和p53抑制途径改变，p16和p53蛋白异常在胰腺癌发生进展中起着重要作用。 中图分类号：R730.231；R735.9文献标识码：A文章编号：1009-4571(2000)02-0138-03Expression of tumor suppressor gene p16 and p53 product in pancreas carcinomaYUAN Rong-wen,JIANG Han-ying,XUE Xin-bo，et al.(Organ Transplantation Research Institute,Tongji Medical University,Wuhan 430030)【Abstract】Objective：To study the relationship between the expression of tumor suppressor gene p16 and p53 product and clinical pathology in pancreas carcinoma,and its role in tumorous genesis.Methods：p16 and p53 protein level were detected by immunohistochemistry in 50 cases of pancreas carcinoma.Results：The positive rate of p16 protein was 48% and much higher in histological stage (80%) than in stage (50%) and stage (25%，P0.05),higher in clinical stage (80%) than in stage (38.9%) and stage + (29.4%,P0.05).The positive rate of p53 protein was 54% and much lower in clinical stage (26.7%) than in stage (61.1%) and stage + (70.6%).Coexistent inactivations of both p16 and p53 was in 17 cases (34%).Conclusions：These two genes function in distinct tumor-suppressive pathways and play an important role in the biology of pancreas carcinoma.【Key words】pancreas carcinoma;p16;p53;immunohistochemistry应用免疫组化技术检测胰腺癌中p16蛋白和p53蛋白的表达，以探讨该两种抑癌基因产物表达同胰腺癌病理和临床分期的关系以及细胞周期抑制通路的改变在胰腺癌发病机制中所起作用。1材料与方法1.1标本来源50例胰腺癌标本取自本院病理科19901996年胰十二指肠切除手术标本，所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。50例中，男31例，女19例，年龄1768岁，平均年龄47.9岁。病理1.2p16蛋白免疫组织化学染色LSAB组合试剂盒购自中山公司，兔抗人p16多克隆抗体为Santa Cruz公司产品。采用免疫组化LSAB法。阳性信号为棕黄色颗粒，位于肿瘤细胞胞浆(图1)。阳性对照为正常乳腺导管上皮细胞，阴性对照为PBS代替一抗。1.3p53蛋白免疫组织化学染色SABC及DAB显色试剂盒购自武汉Boster(博士德)公司，p53单克隆抗体购自美国Zymed公司。采用免疫组化SABC法。阳性信号为棕黄色颗粒，位于肿瘤细胞胞核，胰腺癌细胞核染色10%定为p53蛋白染色阳性(图2)。阳性对照为已知胃癌p53表达阳性细胞，阴性对照为PBS代替一抗。图1癌巢p16蛋白染色强阳性(400)图21例组织学级胰腺乳头状腺癌p53蛋白染色阳性，阳性物质位胞核(400)1.4统计学处理采用2检验。2结果2.1p16和p53蛋白在胰腺癌中的表达特征阴性对照和空白对照中胞核、胞质均未染色。p16蛋白表达主要定位于细胞质，也有少数胞核存在棕色颗粒，p16蛋白阳性胰腺癌中，癌巢周围正常间质细胞多为阳性或弱阳性染色，p16蛋白阴性胰腺癌中，其癌巢周围正常间质细胞多为阳性和弱阳性，亦可为阴性。50例胰腺癌中24例p16表达阳性，阳性率为48%；p53蛋白表达主要定位于细胞核，阳性细胞分布呈片状或簇状，50例胰腺癌中27例p53表达阳性，阳性率为54%。2.2p16和p53蛋白表达与胰腺癌组织学类型的关系p16与p53阳性表达在不同病理类型中无显著性差异(表1)。表1p16和p53蛋白表达与病理类型、组织学分级和临床病理之间的关系类型总例数p16蛋白表达阳性(%)P值p53蛋白表达阳性(%)P值病理类型腺管性腺癌3015(50)19(63)腺泡细胞腺癌82(25)2(25)0.050.05乳头状腺癌96(66.7)5(55.6)粘液腺癌31(33.3)1(33.3)组织学分级108(80)4(50)2412(50)0.0512(50)0.05164(25)11(68.8)Hermrec KAS分期期1512(80)4(26.7)期187(38.9)0.0511(61.1)0.05+期175(29.4)12(70.6)2.3p16和p53蛋白表达与胰腺癌组织学分级的关系p16在组织学分级级中阳性表达率为80%，级中为50%，级中为25%，阳性表达率在不同组织学分级中有显著性差异；而p53阳性表达率在不同组织学分级间无显著性差异(表1)。2.4p16和p53蛋白表达与胰腺癌临床分期的关系p16和p53蛋白表达在不同临床分期间有显著性差异，临床Hermrec KAS分期期p16蛋白表达率显著高于期和、期，分别为80%、38.9%和29.4%；而p53蛋白表达率却显著低于期和、期，分别为26.7%、61.1%和70.6%(表1)。2.5p16和p53蛋白表达之间的关系50例胰腺癌中p16(+)及p53(+)10例(20%)；p16(+)而p53(-)14例(28%)；p16(-)而p53(+)17例(34%)；p16(-)及p53(-)9例(18%)。3讨论由p16基因转录翻译合成的p16分子为15.84kD单链多肽，p16蛋白和cyclin D1竞争与CDK4结合，抑制CDK4的活性，调节细胞周期中G1-S的限制点，阻滞细胞周期从G1期进入S期，从而影响细胞周期进程，在抑制肿瘤形成中起重要作用。研究证实，p16基因突变或缺失存在于多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中，它在许多人类肿瘤的发生、发展中起重要作用，参与调控p16基因表达的因素很多，除基因缺失和突变外，Rb蛋白、p53蛋白、TGF-及CDK4蛋白也参与p16蛋白功能的调控1。影响p16蛋白的表达除p16基因本身改变外，p16基因5端CpG过度甲基化(hypermethylation)可使基因转录受阻，从而在转录水平灭活p16基因2，另外Rb蛋白、p53蛋白、TGF-、CDK4蛋白在转录后水平也参与对p16蛋白的调控3，所以，以免疫组化方法可检测出p16蛋白最终表达水平，忽略影响p16蛋白各种具体因素和过程，方法简单易行，并且能同病理分型、分级和临床指标综合分析。Reed等首次运用免疫组化染色研究p16蛋白在恶性黑色素瘤不同阶段的表达，发现非典型增生和原位癌阳性率为100%，而早期浸润癌和已转移的恶性黑色素瘤阳性率分别为72%和52%，表明p16表达水平与恶性黑色素瘤病程密切相关4。本组结果显示，胰腺癌p16蛋白的阳性表达率在不同病理类型中无显著性差异；在组织分化程度高的病例组中p16蛋白阳性率明显高于低分化组，临床Hermrec KAS分期期p16蛋白表达率显著高于期和、期，统计学有显著性差异，表明p16蛋白阳性与胰腺癌预后好的因素相关。胰腺癌中p53阳性表达率为54%，在不同病理类型和组织学分级中表达率并无显著性差异，但在临床分期中、期阳性表达率高于期和期，统计学上有显著性差异，本组结果与Lundin3、Yokoyama4等人结果相近，但有作者报道p53蛋白表达与胰腺癌组织学分级、临床病理特点和预后均无明显相关性5，对此有待于进一步研究。现代认为，肿瘤是多基因突变累积的结果6。当含有某一基因突变的细胞超过邻近细胞获得优势生长时，可形成该基因突变的细胞克隆。这种生长优势通常是由于突变基因的蛋白产物改变了细胞正常生长调节通路。如果在某一肿瘤抑制通路上的1个基因发生突变，位于此抑制通路的第2个基因突变并不增加该突变基因克隆的生长优势，即不会获得作用于同一通路上的2个突变基因克隆株。所以若肿瘤同时存在不同基因突变则表明这些基因作用于不同的肿瘤抑制通路，否则不会被克隆选择。例如肉瘤和神经胶质瘤中p53突变和其抑制物MDM2的扩增作用于同一抑制通路，基因改变分布在不同个体7，8；肺癌和黑色素瘤中位于同一抑制通路上的Rb1、p16和CDK4基因突变亦发生在不同个体9，10；与之相反，黑色素瘤和膀胱癌中p16和p53突变可存在于同一个体10，表明黑色素瘤和膀胱癌发病机制在于不同抑制通路发生改变的结果积累。本组中p16发生缺失同时伴有p53基因突变，即p16(-)、p53(+)共17例，占34%，充分证明在胰腺癌发生中存在p16抑制途径和p53抑制途径改变的积累；另外仅有p16缺失者9例(18%)，仅有p53突变者10例(20%)，50例中共有36例(72%)发生p16基因或/和p53基因的变异，可见p16和p53蛋白异常在胰腺癌发生进展中起着重要作用。参考文献：1Florenes VA,Maelandsmo GM,Hovig E,et al.CDKN2 gene inactivation and expression levels in sporadic human malignant melanomas.Relationship to the status of CDK4、CyclinD1 and pRb.Am.AssocJ.Cancer Res,1995,36:572-573.2Lo KW,Cheung ST,Leung SF,et al.Hypermethylation of the p16 gene in NPCJ.Cancer Res,1996,56:2493-2494.3Lundin J,Nordling S,von Boguslawsky K,et al.Pronostic value of immunohistochemical expression of p53 in patients with pancreatic cancerJ.Oncology,1996,53(2):104-106.4Yokoyama M,Yamanaka Y,Friess H,et al.p53 expression in human pancreatic cancer correlates with enhanced biological aggressivenessJ.Anticancer Res,1994,14(6B):2477-2478.5Zhang SY,Ruggeri B,Agarwal P,et al.Immunohistochemical analysis of p53 expression in human pancreatic carcinomasJ.Arch Patho Lab Med,1994,118(2):150-152.6Fearon ER and Vogelstein B.A genetic model for colorectal tumorigenesisJ.Cell,1990,61:759-760.7Oliner JD,Kinzler KW,Meltzer PS,et al.Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in