GUS基因的定性和定量检测.docx

1GUS报告基因的定性检测GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。GUS染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。1.1 GUS染色底物的配制按下表1配制GUS染色的底物。表1. GUS染色底物的配制试剂名称母液浓度母液配制方法工作液浓度工作液配制方法磷酸缓冲液（pH 7.2）0.5M将0.5M Na2HPO4和0.5M NaH2PO4混合*50mM1 mlTriton X-10010%取10ml Triton X-100溶于水，定容至100ml。0.1%0.1 ml铁氰化钾K3Fe(CN)6100mM将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。2 mM0.2 ml亚铁氰化钾K4Fe(CN)63 H2O100mM将4.2239g亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml。2 mM0.2 mlEDTA0.5M将18.61gNa2EDTA2H20溶于水，调pH为8.0，定容至100ml水。10 mM0.2 mlX-Gluc/2 mM10.4mgddH2O/定容至10ml* 0.5M Na2HPO4配制方法：将17.907g Na2HPO4溶于水，定容至100ml。0.5M NaH2PO4的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml。1.2染色步骤1)染色：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37保温箱中放置6h。2)漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。3)脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。4)记录：在体视显微镜下拍照记录。2GUS报导基因的定量检测GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferyl-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。2.1试剂配制1)1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。2)1mol/L NaH2PO4溶液：15.601g NaH2PO4溶于100ml水。3)0.1M磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。4)10SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。5)0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。6)GUS酶提取液：0.1M磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml；0.5M EDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。7)MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。8)反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3）：称2.12Na2CO3，用水定容到100ml。9)考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO410ml，定容至l00ml，过滤后4保存。10)mg/ml BSA：20mg BSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。2.2植物总蛋白的提取1)取新鲜的植物组织100mg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80冰箱。2)将研磨破碎的组织转到Ep管里，并立即加入1ml的GUS提取缓冲液，充分混匀。3)12,000rpm, 4离心5min，将上清转至另一洁净的Ep管，冰上放置待用。2.3蛋白浓度的测定（Bradford法）1)取7个Ep管，分别加入0l、2l、4l、8l、12l、16l、20l的BSA标准液，用水补至相同体积20l。加入980l的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以蛋白浓度（mg/ml）对吸收值A595做标准曲线。2)取待测蛋白样品10l，加10l水，加入980l的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。代入公式，求出蛋白样品的浓度。2.4GUS表达水平的定量测定1)取100l蛋白上清，加入400l 37预热的GUS提取缓冲液里，再加入500l MUG底物，37温浴。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200u1加入到800u1反应终止液，室温避光保存。2)用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm