一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂对髓核细胞线粒体功能的影响.doc

www.CRTER.org周建国，等. 一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂对髓核细胞线粒体功能的影响一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂对髓核细胞线粒体功能的影响周建国1，杨 操2，熊蠡茗2(1赣州市人民医院骨科，江西省赣州市 341000；2华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430022)引用本文：周建国，杨操，熊蠡茗*.一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂对髓核细胞线粒体功能的影响J.中国组织工程研究，2016，20(42):6278-6283.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.007 ORCID: 0000-0001-6651-2701(周建国)文章快速阅读：一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂烟酰胺影响兔髓核细胞线粒体功能的及其生物学行为周建国，男，1984年生，汉族，硕士, 主要从事椎间盘退变与创伤外科研究。通讯作者：熊蠡茗，博士, 副教授, 华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430022中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)42-06278-06稿件接受：2016-07-16检测指标：(1)髓核细胞增殖活力；(2)细胞内ATP浓度；(3)细胞内活性氧水平；(4)细胞内一氧化氮合酶活性；(5)髓核细胞线粒体膜电位。 正常空白对照组10 mol/L 硝普钠组100 mol/L硝普钠组200 mol/L硝普钠组0.05 g/L烟酰胺组(100 mol/L硝普钠+0.05 g/L烟酰胺)0.5 g/L烟酰胺组(加入100 mol/L硝普钠和0.5 g/L烟酰胺干预)体外培养的兔腰椎间盘髓核细胞 文题释义：髓核：是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。婴幼儿时期的髓核含水量为80%-90%，即使到了老年，其含水量也在70%上下。线粒体：是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为“power house”。其直径在0.5-1.0 m。摘要背景：一氧化氮可通过诱发炎性细胞因子的释放，进而干扰细胞线粒体功能，加速椎间盘损伤及退变，是压力等外界因子导致椎间盘退变的重要炎性细胞递质。目的：分析一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂烟酰胺对兔髓核细胞线粒体功能的影响及其与髓核细胞生物学行为的相关性。方法：将体外培养的兔腰椎间盘髓核细胞分为6组，正常空白对照组、10 mol/L 硝普钠组、100 mol/L硝普钠组、200 mol/L硝普钠组、0.05 g/L烟酰胺组(100 mol/L硝普钠+0.05 g/L烟酰胺)、0.5 g/L烟酰胺组(加入100 mol/L硝普钠和0.5 g/L烟酰胺干预)，向各组培养基内加入不同剂量的一氧化氮供体硝普钠及烟酰胺进行干预。干预3 d后检测髓核细胞增殖活力、细胞内ATP浓度、细胞内活性氧水平、细胞内一氧化氮合酶活性以及髓核细胞线粒体膜电位。结果与结论：兔髓核细胞经不同浓度的硝普钠干预3 d后，细胞内一氧化氮合酶量随硝普钠浓度加大而增加、ATP浓度则随着减小，与正常对照组比较差异有显著性意义(P 0.01)；硝普钠组可提高髓核细胞内活性氧水平, 烟酰胺组呈剂量依赖性改善因硝普钠干预下的细胞内活性氧水平(P 0.01)；硝普钠组可引起髓核细胞膜电位下降，烟酰胺组可减轻因硝普钠引起的膜电位下降(P 0.01)；与硝普钠组比较烟酰胺组也呈剂量依赖性促进髓核细胞增殖(P 0.01)及改善髓核细胞的增殖活力，2组之间差异有显著性意义(P 0.01)；结果说明，过量一氧化氮可损伤兔髓核细胞线粒体功能而导致细胞能量代谢障碍，烟酰胺能够通过抑制一氧化氮的合成以及保护椎间盘细胞线粒体功能和改善细胞能量代谢，有助于预防椎间盘退变。关键词：组织构建；软骨组织工程；髓核细胞；线粒体；一氧化氮；烟酰胺；一氧化氮合酶；能量代谢；国家自然科学基金主题词：线粒体；一氧化氮；一氧化氮合酶；组织工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 基金资助：国家自然科学基金青年基金项目(30700841)；江西省赣州市科技计划项目(3202745)Effects of nitric oxide and nitric oxide synthase inhibitors on mitochondrial function of nucleus pulposus cells Zhou Jian-guo1, Yang Cao2, Xiong Li-ming2 (1Department of Orthopedics, Peoples Hospital of Ganzhou, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China; 2Department of Orthopedics, Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China)AbstractBACKGROUND: Nitric oxide can interfere with the function of mitochondria, and accelerate the intervertebral disc damage and degeneration by interfering with the release of inflammatory cytokines. Nitric oxide is an important inflammatory cell medium leading to degeneration of intervertebral disc induced by pressure and other external factors. OBJECTIVE: To investigate the regulatory effect of nitric oxide and nitric oxide synthase inhibitor niacinamide on mitochondrial function and its association with biological behavior of rabbit nucleus pulposus. METHODS: Cultured nucleus pulposus cells of rabbit lumbar intervertebral disc were randomly divided into six groups: normal blank control group, 10 mol/L sodium nitroprusside group, 100 mol/L sodium nitroprusside group, 200 mol/L sodium nitroprusside group, 0.05 g/L nicotinamide group (100 mol/L sodium nitroprusside+0.05g/L nicotinamide), and 0.5 g/L nicotinamide group (100 mol/L sodium nitroprusside and 0.5 g/L nicotinamide). Different doses of nitric oxide donor sodium nitroprusside and nicotinamide were added in the medium of each group. Three days after intervention, cell proliferation activity, intracellular ATP concentration, cell nitric oxide synthase activity, cellular reactive oxygen species level, and mitochondrial membrane potential were detected respectively. RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 3 days of rabbit nucleus pulposus cells intervened by different concentrations of sodium nitroprusside, intracellular nitric oxide synthase content increased with sodium nitroprusside volume increase, and ATP concentration decreased along with sodium nitroprusside volume increase; there were significantly differences between the normal control group and sodium nitroprusside groups (P 0.01). (2) Reactive oxygen species could be increased in the sodium nitroprusside group. Niacinamide groups indicated a dose-dependent manner to improve the increase of cellular reactive oxygen species levels with sodium nitroprusside intervention (P 0.01). (3) In the sodium nitroprusside groups, nucleus pulposus cell membrane potential decreased. In the niacinamide groups, sodium nitroprusside- induced decline in mitochondrial membrane potential was reduced (P 0.01). (4) Niacinamide groups also indicated a dose-dependent manner to improve the proliferative activity of nucleus pulposus cells as compared with sodium nitroprusside groups (P 0.01). Significant differences were determined between the two groups (P 0.01). (5) Results suggest that the excess nitric oxide can damage mitochondrial metabolic function of rabbit nucleus pulposus cells and cause cell energy metabolism. Niacinamide can reverse these damages by inhibiting nitric oxide synthesis, thereby contributing to the prevention against intervertebral disc degeneration. Subject headings: Mitochondria; Nitric Oxide; Nitric Oxide Synthase; Tissue EngineeringFunding: the Youth Fund Project of National Natural Science Foundation of China, No. 30700841; the Science and Technology Planning Project of Ganzhou City of Jiangxi Province, No. 3202745Zhou Jian-guo, Master, Department of Orthopedics, Peoples Hospital of Ganzhou, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, ChinaCorresponding author: Xiong Li-ming, M.D., Associate professor, Department of Orthopedics, Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, ChinaCite this article: Zhou JG, Yang C, Xiong LM. Effects of nitric oxide and nitric oxide synthase inhibitors on mitochondrial function of nucleus pulposus cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(42):6278-6283.6283ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction椎间盘退行性变是一系列脊柱退行性疾病如椎间盘突出、腰椎管狭窄等的前提和基础病理过程。这一过程可表现为椎间盘内营养物质的缺乏，诱发炎性细胞递质的级联释放，导致椎间盘细胞的细胞增殖、凋亡等生物学行为改变，从而促进椎间盘损伤修复失衡。细胞的能量代谢障碍是椎间盘退变及损伤的重要机制，与细胞线粒体能量代谢密切相关1。一氧化氮可通过诱发炎性细胞因子的释放，进而干扰细胞线粒体功能，加速椎间盘损伤及退变，是压力等外界因子导致椎间盘退变的重要炎性细胞递质2。但椎间盘内一氧化氮如何干扰椎间盘髓核细胞线粒体功能代谢、其损害与髓核细胞生物学行为变化有什么相关性均未见报道。实验拟通过体外培养兔髓核细胞，以一氧化氮供体硝普钠调节培养基内一氧化氮浓度，并加入一氧化氮合酶抑制剂烟酰胺进行干预调节，体外分析椎间盘髓核细胞的炎性细胞递质的变化及细胞线粒体功能代谢变化；同时椎间盘内髓核细胞的增殖、凋亡等生物学行为变更；并综合评价一氧化氮及烟酰胺对髓核细胞线粒体能量代谢功能的影响及其相关机制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 分组对照细胞学实验。1.2 时间及地点 实验于2011年12月至2013年10月在华中科技大学同济医学院附属协和医院和赣州市人民医院完成。1.3 材料 2月龄左右日本大白兔10只，雌雄不限，华中科技大学同济医学院附属协和医院实验动物中心提供。1.4 实验方法1.4.1 兔髓核细胞分离培养及分组 取2月龄左右日本大白兔10只。空气栓塞致死后立即在无菌条件下完整取出整个腰段脊柱，仔细剥离纤维环后获得髓核组织。DMEM/F12细胞培养基反复漂洗后，剪成髓核组织呈浆糊状。型胶原酶37 下充分消化25 min，200目网筛过滤，1 000 r/min离心5-7 min，去除上清液，再用培养基清洗2次后用含血清的培养基冲洗1次，将消化下来的髓核细胞培养于12孔培养板，并置于37 、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中作原代髓核细胞培养，每两三天换液1次。体外培养兔髓核细胞分为6组，分别加入不同浓度的一氧化氮供体硝普钠及烟酰胺进行干预：分组处理方法：组别处理正常空白对照组不加入药物10 mol/L 硝普钠组加入10 mol/L硝普钠干预100 mol/L硝普钠组加入100 mol/L硝普钠干预200 mol/L硝普钠组加入200 mol/L硝普钠干预0.05 g/L烟酰胺组加入100 mol/L硝普钠+0.05 g/L烟酰胺干预0.5 g/L烟酰胺组加入100 mol/L硝普钠和0.5 g/L烟酰胺干预干预3 d后进行相关检测。1.4.2 CCK-8检测 按照CCK-8检测试剂盒说明书操作：将3代培养的髓核细胞以1107 L-1细胞浓度接种于96孔板内，每孔加入200 L，每组设立5个复孔，置于37 、含体积分数5%CO2的细胞培养箱内培育3 d。干预3 d后，每组每孔加入20 L CCK-8溶液，充分震荡摇匀，置于37 、含体积分数5%CO2的细胞培养箱内避光孵育2 h后，450 nm测定细胞吸光度值(A)。1.4.3 活性氧检测 按照活性氧检测试剂盒说明书操作，检测髓核细胞内活性氧水平。将培养的细胞以2107 L-1细胞浓度接种于12孔板内，每孔1 mL。干预3 d后按照试剂盒说明书检测细胞内活性氧水平：细胞收集后重悬于稀释好的检测液中，使细胞浓度为(1.0-2.0)109 L-1，37 细胞培养箱内孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次后，立即以激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，用荧光分光光度计检测相对荧光强度。1.4.4 ATP浓度检测 按照ATP检测试剂说明书操作，检测各组髓核细胞内ATP浓度。干预3 d后，弃培养液后6孔板每孔加入200 L裂解液，充分裂解后4 12 000g 离心10 min，收取上清；冰上溶解ATP检测试剂，每个检测管内先加入100 L ATP检测工作液，室温放置 3-5 min，再加100 L 待测上清到检测管内，迅速混匀，立即用luminometer测定相对荧光强度，根据标准曲线计算出每组髓核细胞内ATP浓度。1.4.5 一氧化氮合酶活性检测 按照一氧化氮合酶检测试剂盒说明书操作，检测髓核细胞内一氧化氮合酶浓度。将培养的细胞以1107 L-1细胞浓度接种于96孔板内，每孔加入200 L，每组设立5个复孔，置于37 、含体积分数5%CO2的细胞培养箱内培育3 d。干预3 d后，去除细胞培养液，加入100 L一氧化氮合酶检测缓冲液，再加入100 L检测反应液，轻轻摇匀。置于37 、含体积分数5%CO2的细胞培养箱内孵育2 h后，取96孔板用荧光酶标记仪检测相对荧光强度(激发波长为495 nm、发射波长为515 nm)，再计算出髓核细胞内一氧化氮合酶活性。1.4.6 线粒体膜电位检测 按照线粒体膜电位JC-1试剂盒说明书操作，检测髓核细胞内线粒体膜电位。将培养的髓核细胞以2107 L-1细胞浓度接种于12孔培养板内，每孔1 mL。干预3 d后，先消化收集髓核细胞，再取适量细胞(约5105)重悬于0.5 mL细胞培养液中，并加入0.5 mL JC-1染色工作液，充分震荡混匀，置于37 、含体积分数5%CO2的细胞培养箱内避光孵育20 min，4 600g离心4.0-5.0 min，去除上清液后，用配置好的预冷染色缓冲液充分漂洗2次，再取适量染色缓冲液重悬髓核细胞，取适量细胞悬液用荧光分光光度计分析细胞红绿荧光比例；同时取出适量细胞悬液放在玻片上，倒置荧光显微镜下观察细胞绿色与红色荧光。1.5 主要观察指标 髓核细胞增殖活力；细胞内ATP浓度；细胞内活性氧水平；细胞内一氧化氮合酶活性；髓核细胞线粒体膜电位。1.6 统计学分析 分组计量资料统计结果均以s表示，采用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，P 0.05为差异有显著性意义。 B AF E D C图 2 兔髓核细胞线粒体m JC-1染色(200)Figure 2 m JC-1 staining of rabbit nucleus pulposus cell mitochondria (200)图注：图A为正常空白对照组，产生红色荧光为主，示细胞线粒体m稳定；B为 10 mol/L硝普钠组，产生红色荧光减少，示细胞线粒体m降低；C为100 mol/L硝普钠组，大部分为绿色荧光，红色荧光较少；D为200 mol/L硝普钠组，产生绿色荧光为主，示细胞线粒体m稳定性极差；E为0.05 g/L烟酰胺组，红色荧光逐渐增多，示细胞线粒体m升高；F为0.5 g/L烟酰胺组，产生红色荧光明显增多，示细胞线粒体m较稳定。1.00.20表1 不同剂量的烟酰胺及硝普钠对髓核细胞作用3d后细胞内活性氧水平、ATP浓度及细胞内一氧化氮合酶量 (s)Table 1 Effects of different doses of nicotinamide and sodium nitroprusside on intracellular reactive oxygen species level, ATP concentration and intracellular nitric oxide synthase levels for 3 days of intervention on nucleus pulposus cellsA450值A B C D E F 表注：与空白对照组比较，aP 0.01；与200 mol/L硝普钠组比较，bP 0.01；与硝普钠组比较，cP 0.01；与0.05 g/L烟酰胺组比较，dP 0.05。组别一氧化氮合酶(U/mL)活性氧 (Flu)ATP (mol/L)空白对照组16.822.10727.831.154.55 0.1110 mol/L 硝普钠组21.722.60a743.171.39a3.850.12a100 mol/L硝普钠组28.322.10a765.451.76ab3.570.13a200 mol/L硝普钠组29.302.40a794.361.50a 3.510.12a0.05 g/L烟酰胺组19.211.80ac600.831.59ac3.670.13ac0.5 g/L烟酰胺组13.122.20acd88.301.49acd3.840.10acd图1 兔髓核细胞细胞增殖活力CCK-8试剂盒检测结果Figure 1 CCK-8 kit test results of proliferation viability of rabbit nucleus pulposus cells图注：图中A为空白对照组；B为10 mol/L 硝普钠组；C为 100 mol/L硝普钠组；D为200 mol/L硝普钠组；E为0.05 g/L烟酰胺组；F为0.5 g/L烟酰胺组。结果表明一氧化氮供体硝普钠对兔椎间盘髓核细胞增殖具有明显抑制作用，一氧化氮合酶抑制剂烟酰胺干扰可明显改善兔椎间盘髓核细胞的增殖活力。表2 不同剂量的烟酰胺及硝普钠对髓核细胞作用3d后髓核细胞红绿荧光比值 (s)Table 2 Red and green fluorescence ratio of nucleus pulposus cells for 3 days of intervention with different doses of nicotinamide and sodium nitroprusside组别红绿荧光比值空白对照组1.640.5810 mol/L 硝普钠组1.430.71a100 mol/L硝普钠组1.120.76ab200 mol/L硝普钠组0.970.71a0.05 g/L烟酰胺组1.360.77ac0.5 g/L烟酰胺组1.660.8acd表注：与空白对照组比较，aP 0.01；与200 mol/L硝普钠组比较，bP 0.01；与硝普钠组比较，cP 0.01；与0.05 g/L烟酰胺组比较，dP 0.05。2 结果 Results2.1 CCK-8检测 各组髓核细胞增殖活力见图1。与空白对照组比较，一氧化氮供体硝普钠干预组呈浓度依赖性抑制髓核细胞增殖(均P 0.01)，其中200 mol/L硝普钠组抑制最强。与硝普钠干预组比较，一氧化氮合酶抑制剂烟酰胺组也呈浓度依赖性增强髓核细胞的增殖能力(均P 0.01)，烟酰胺2组间差异有显著性意义(P 0.01)。结果表明一氧化氮对兔椎间盘髓核细胞增殖具有明显抑制作用，干扰一氧化氮的合成可明显改善兔椎间盘髓核细胞的增殖活力。2.2 活性氧检测 用荧光分光光度计分析各组髓核细胞内活性氧水平，与对照组比较，硝普钠干预组呈浓度依赖性提高髓核细胞内活性氧水平(均P 0.01)，以200 mol/L硝普钠组刺激最强。而与硝普钠干预组比较，烟酰胺组也呈浓度依赖性降低髓核细胞内活性氧水平(均P 0.01)，烟酰胺2组间差异有显著性意义(P 0.01)，见表1。 2.3 一氧化氮合酶及ATP含量检测 分别用荧光酶标记仪、luminometer测定检测一氧化氮合酶及ATP相对荧光强度：加入硝普钠后10 mol/L 硝普钠组、100 mol/L硝普钠组、200 mol/L硝普钠组一氧化氮合酶活性与正常对照组比较均有所增强，其中200 mol/L硝普钠组刺激作用最强(P 0.01)，而ATP浓度均较正常对照组有所下降(P 0.01，P 0.01，P 0.05)，存在最大刺激剂量效应。与200 mol/L硝普钠组比较，烟酰胺组一氧化氮合酶的活性显著下降(P 0.05)，ATP浓度显著增加(P 0.05，见表1。结果表明烟酰胺可抑制一氧化氮合酶的生物活性、减少一氧化氮的合成、改善细胞内ATP浓度，从而改善髓核细胞的能量代谢、抑制髓核细胞的过量的凋亡。2.4 线粒体膜电位检测 采用倒置荧光显微镜下观察细胞绿色与红色荧光：细胞内线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中螯合成聚合物，从而产生红色荧光；而电位低时，JC-1不能聚集螯合形成聚合物，则产生绿色荧光。倒置荧光显微镜下观察显示，空白对照组以红色荧光为主，提示该组线粒体膜电位(m)稳定，髓核细胞功能正常(图2A)；硝普钠组则以产生绿色荧光为主，提示髓核细胞内线粒体m明显下降(图2B，C，D)；而加了硝普钠和烟酰胺0.05 g/L烟酰胺组、0.5g/L烟酰胺组与单纯硝普钠组比较，则红色荧光依烟酰胺浓度增加而增强(图2E、F)，二者间差异有显著性意义(P 0.05)。采用荧光分光光度计分析各组髓核细胞红绿荧光比值：硝普钠干预组红绿荧光比值较正常对照组均明显下降(均P 0.01)，其下降程度与硝普钠浓度相关，以200 mol/L硝普钠组下降最明显，组间有显著性差异 (P 0.05)；而烟酰胺组较硝普钠组均有明显上升(均P 0.01)，2组之间差异有显著性意义(P 0.05)(表2)。结果表明一氧化氮可通过激发椎间盘髓核细胞内一氧化氮合酶、活性氧的活性，从而损害兔椎间盘髓核细胞增殖活性、诱发髓核细胞凋亡，诱导型一氧化氮合酶抑制剂通过干扰一氧化氮的合成，从而改善椎间盘髓核细胞线粒体功能，促进椎间盘髓核细胞的增殖活性。3 讨论 Discussion椎间盘退变是多种环境因素共同作用的结果，其机制研究一直为国内外学者研究的热点。椎间盘细胞能量代谢障碍是腰椎间盘退行性改变的一个重要机制。一方面是压力、外伤等外界因素加速椎间盘软骨终板的退变，而软骨终板的退变导致椎间盘内营养物质弥散障碍，进而促进炎症细胞因子的释放，进一步可导致细胞内线粒体变形、线粒体内渗透压改变等，从而干扰细胞能量代谢1；一方面是能量代谢障碍诱发细胞凋亡加速，促进椎间盘内细胞基质代谢失衡，导致椎间盘进入难以自行修复的退变3-5。一氧化氮作为一活泼的生物小分子，是由一氧化氮合成酶于L-精氨酸产生的，它具有很强的细胞毒性功能，可通过多种途径产生组织细胞损伤作用。有报道显示在腰椎间盘突出症患者的椎间盘组织表达诱导型一氧化氮合酶mRNA，诱发一氧化氮过量释放，促进炎性细胞递质的大量释放，进而增强胶原酶和基质金属蛋白酶活性，促进型胶原及细胞基质的裂解，导致椎间盘内细胞及基质紊乱，从而造成椎间盘退变6-8。另一方面，一氧化氮可进一步激活多聚 ADP-核糖聚合酶 (Poly ADP-ribose polymerase，PARP)，从而大量消耗NAD，导致细胞内糖酵解速度的降低、线粒体呼吸链的电子传递减缓；此外，一氧化氮还可导致细胞内产生过量的活性氧，使得细胞内线粒体的膜脂质过度氧化，不但直接损伤细胞，而且直接抑制细胞内线粒体的呼吸，引起细胞内ATP减少，从而导致细胞凋亡9-10。烟酰胺是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即辅酶(NAD)的前体，在生物氧化过程中起递氢作用，其具有抗自由基抗氧化作用从而减少线粒体损伤，保护线粒体呼吸功能，改善线粒体能量代谢从而促进细胞能量代谢的作用11-12。以往研究报道了烟酰胺在体外表现可促进转化生长因子1的合成及抑制白细胞介素1诱导的诱导型一氧化氮合酶的表达而降低一氧化氮合成与释放，改善椎间盘细胞能量代谢，促进细胞增殖和减少细胞凋亡的作用，进而促进椎间盘组织内aggrecan和胶原的合成及分泌，从而能抵抗白细胞介素1导致的基质结构破坏，改善椎间盘退变13。实验通过向体外兔椎间盘髓核细胞培养基内加入不同浓度的硝普钠，诱发髓核细胞凋亡，激发一氧化氮合酶的活性，促进的一氧化氮分泌，后加入不同剂量的特异性诱导型一氧化氮合酶抑制剂烟酰胺，抑制一氧化氮合成而改善细胞线粒体功能。综合实验结果显示：与正常对照组比较，硝普钠干预组不但可浓度依赖性增加髓核细胞内一氧化氮合酶活性，并提高髓核细胞内活性氧水平，还可浓度依赖性减少髓核细胞内ATP浓度、降低髓核细胞线粒体膜电位及抑制髓核细胞增殖，分析其机制可能与一氧化氮氧化损伤髓核细胞线粒体功能引起能量代谢障碍以及激活凋亡相关蛋白引起线粒体释放细胞色素C途径激发细胞凋亡14-16。而烟酰胺干预组以浓度剂量依赖性降低髓核细胞内一氧化氮合酶活性及活性氧水平、提升髓核细胞线粒体膜电位水平、增加髓核细胞内ATP量、改善髓核细胞的增殖能力，这可能主要与烟酰胺抑制诱导型一氧化氮合酶的表达而降低一氧化氮合成，减少线粒体损伤及保护线粒体功能改善细胞能量代谢。此外烟酰胺具有较强抗炎抗自由基作用17-18。综上所述，一氧化氮可明显提高髓核细胞内活性氧水平，使得细胞内脂质过氧化，从而改变髓核细胞膜通透性，损害髓核细胞的线粒体能量代谢功能，诱发炎性细胞因子的合成及释放，进一步降低髓核细胞增殖活力，激发髓核细胞凋亡；而烟酰胺能够通过抑制诱导型一氧化氮合酶的表达，降低一氧化氮合成与释放，减少炎性细胞递质的分泌，改善髓核细胞的内环境，减轻一氧化氮对髓核细胞线粒体功能的损害，进一步保护髓核细胞能量代谢而改善椎间盘退变。因此，改善椎间盘细胞内环境的稳定，可改善髓核细胞的线粒体功能，进而保护细胞能量代谢有助于预防椎间盘退变；通过抑制一氧化氮的合成，减少炎性细胞递质的级联反应，进一步保护退变椎间盘内细胞线粒体的能量代谢功能，则有可能抑制椎间盘细胞凋亡，从而改善甚至逆转椎间盘退变。这也提示可以用特异性抑制一氧化氮合酶或一氧化氮的药物如烟酰胺来阻止或延缓椎间盘退变，为临床上预防和治疗椎间盘退变开辟一条新的途径。作者贡献：设计、评估为第一作者和通讯作者，实施为全体作者，否盲法评估。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 聂克,杨述华,熊蠡茗,等.AMPK与P16ink4在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及其意义J.中国中医骨伤科杂志, 2009,17(1):8-10.2 柳根哲,徐林,李春根,等.静水压对人体腰椎间盘一氧化氮产生及蛋白多糖合成的影响J.中国临床康复,2005,9(2): 100-102. 3 Le Maitre CL, Pockert A, Buttle DJ, et al. Matrix synthesis and degradation in human intervertebral disc degeneration. Biochem Soc Trans.2007; 35( 4):652-655.4 徐蔚蔚,邵增务,郭兵,等.烟酰胺对椎间盘、型胶原的保护作用J.中国中医骨伤科杂志, 2008, 16(6): 21-25.5 Benneker LM, Heini PF, Alini M, et al. 2004 Young Investigator Award Winner:vertebral endplate marrow contact channel occlusions and intervertebral disc degeneration.Spine.2005;30(2):167-73.6 Xu RB, Shao ZW, Xiong LM, et al. Experimental Study on Inhibitory Effect of Niacinamide on Tumor Necrosis Factor-alpha-induced Matrix Degradation of Annulus Fibrous Tissue in vitro. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci.2008; 28 (5):576-579.7 Rannou F, Richette P, Benallaoua M, et al. Cyclic tensile stretch modulates proteoglycan production by intervertebral disc annulus fibrosus cells through production of nitrite oxide. J Cell Biochem.2003;90(1): 148-157.8 Liu GZ,Ishihara H,Osada R,et al.Nitric oxide mediates the change of proteoglycan synthesis in the human lumbar intervertebral disc i