丛枝菌根研究方法.doc

丛枝菌根研究方法1.检测孢子含量的方法（湿筛倾注蔗糖离心法）1.Gerdemann J W, Nicolson T H,1963. Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, 46: 235-2442.刘润进，李晓林2000丛枝菌根及其应用北京：科学出版社：190-194根据上述方法略有改动1. 称取10 g菌剂，置入大烧杯中加500 ml水，搅拌，静置10 s。2. 先后过80目分样筛、400目分样筛，将400目筛子上的残余物用药匙转入50ml 离心管中，后用清水冲洗筛子，将残余物全部转入离心管中，配平，3000转/min 离心10 min。（注分样筛最好直径为12 cm左右，便于下面放置烧杯过筛）3. 去掉上清液，在离心管中加入预先配制好的质量分数为50%的蔗糖溶液，玻璃棒搅匀，配平，3000转/min 离心10 min（注意离心前离心管壁上不能有残余物）。4. 将400目筛子呈一斜面放置，离心后的蔗糖溶液过筛子的下侧，用水将筛子上的残留物轻轻洗入划线培养皿中。（注意水不能加太多以防影响检测，培养皿划线便于统计）。 5. 解剖镜镜检统计培养皿中的孢子数目，计算出菌剂中的孢子含量。 注：溶于蔗糖溶液中的孢子仍可进行接种。2.检测菌根侵染率的方法（曲利苯蓝染色法）Phillips J M，Hayman D S，1970. Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55: 158161 根据上述方法略有改动1.将洗净的幼苗根系剪成 1 cm左右的根段，用FAA固定液（70%酒精：甲醛：冰醋酸=90：5：5）固定24 h。2.加入10% KOH在 100的恒温干燥箱内反应45 min(去除细胞质，便于染色。一般来说，幼根需要时间较短，大约只要 0.5 h，老根需要时间长，大约1 h，以根系相对透明为标准)。3.洗去碱液，加入10% H2O2漂白15 min，用蒸馏水清洗，加入0.2 molL-1盐酸酸化 1h以上(可以延长，曲利苯蓝为酸性染料，需酸化，酸化时间应不少于30 min)。4.曲利苯蓝(Trypan blue)乳酸酚溶液(乳酸 100 mL，甘油 100mL，苯酚 100 mL,蒸馏水 100 mL，曲利苯蓝 0.2 g)染色 5 min。5.乳酸酚(乳酸 100 ml，甘油 100 mL，苯酚 100 mL,蒸馏水100 mL)脱色15min。6.制片，镜检。7.试验中可用自来水代替蒸馏水,苯酚有毒，进行染色、脱色步骤时需在通风橱中进行，实验人员需戴口罩。说明：常规制片用水即可，用封固剂（聚乙烯醇1.66g，甘油1 ml，乳酸20ml ，蒸馏水10ml）制片片子可以保存较长时间，但容易产生气泡，另聚乙烯醇有毒需小心。 经脱色后的植物根系可以在甘油中保存数月。3.统计方法 Trouvelot A, Kough JL & Gianinazzi-Pearson V (1986) Mesure du taux de mycorhization VA dun systme radiculaire. Recherche de mthodes destimation ayant une signification fonctionnelle. In : Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae, V. Gianinazzi-Pearson and S. Gianinazzi (eds.). INRA Press, Paris, pp. 217-221. Estimation of AMF colonisation Estimation of mycorrhizal colonization according to Trouvelot et al丛枝菌根真菌侵染性的评估方法(Trourelot等，1986)a. Mount 15 root fragments on one slide; prepare two slides (30 root fragments total).1.将15个根段固定在1张载玻片上，30个染色后的植物须根根段制2个片子。b. Observe these fragments under the microscope and rate according to the range of classes indicated in figure 1. These classes give a rapid estimation of the level of mycorrhizal colonisation of each root fragment and the abundance of arbuscules.2.在显微镜下观察这些根段，按照图1的分类方法确定分级，这种分级包括对每个根段菌根侵染率水平和丛枝丰度的快速评估。c. Put the values into the computer program Mycocalc to calculate the parameters: %F, %M, %m, %a and %A, according to Trouvelot et al. 1986. (see Figure 1 from Trouvelot et al 1986)3.将观测值代入计算机软件“Mycocale”中即可按照以下相关公式计算出相关的菌根侵染度参数：%F,%M,%m, %a和%A o Frequency of mycorrhiza in the root system根系中的菌根侵染率(%F)=有菌根根段数/总根段数*100o F% = ( nb of fragments myco/total nb)*100 o Intensity of the mycorrhizal colonisation in the root system根系中的菌根侵染强度(%M)=( 95*侵染率90%以上根段数+70*侵染率50%至90%的根段数+30*侵染率10%至50%的根段数+ 5*侵染率10%以下1%以上根段数+ 侵染率1%以下根段数)/总根段数*100o M% = (95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/(nb total)where n5 = number of fragments rated 5; n4 = number of fragments 4 etc. o Intensity of the mycorrhizal colonisation in the root fragments相对菌根强度即根段中的菌根侵染强度(%m)=M*总根段数)/有菌根根段数o m% = M*(nb total)/(nb myco) o Arbuscule abundance in mycorrhizal parts of root fragmentsa% = (100mA3+50mA2+10mA1)/100(相对丛枝率)菌根根段丛枝率(%a)=( 100*mA3+50mA2 + 10mA1)/100,其中mA3,mA2,mA1分别是A3，A2，A1所对应的菌根侵染强度o where mA3, mA2, mA1 are the % of m, rated A3, A2, A1, respectively, with mA3=(95n5A3+70n4A3+30n3A3+5n2A3+n1A3)/nb myco)*100/m and the same for A2 and A1. o Arbuscule abundance in the root system(绝对丛枝率)根系丛枝率(A%) = a*(M/100)Figure 1注：现在找不到“Mycocale”这个软件了，我一般都是显微镜检测后自己计算结果。统计菌根侵染率的方法有很多，有网格交叉法、频率标准法等，可以搜一下相关文献。另附丛枝菌根及其应用（刘润进，李晓林主编，2000，科学出版社）的190-199页。4