DGGE实验.doc

DGGE的基本原理 DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis变性梯度凝胶电泳)不是将分子量不同的DNA分开,而是通过PAGE(聚丙烯酰胺)凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE,即变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。DGGE实验 一1. 制胶：使用梯度胶制备装置，分别制备30%和60%的变性胶。DGGE制胶参数制胶30%变性胶的配置20（ml）60%变性胶的配置20（ml）40%丙烯酰胺（Bis-Acr）5ml5ml50TAE400ul400ulFormamide去离子甲酰胺2.4ml4.8ml尿素（urea）2.52g5.04gDdH2O定容至20ml定容至20ml最后加（几分钟内凝固）10%AP(APS)100ul100ulTEMED20ul20ul试剂配方：40%丙烯酰胺（Bis-Acr）：Acrylamide 丙烯酰胺 38.93g Bis-acylamide 双丙烯酰胺 1.07g蒸馏水定容至100ml50TAE：TrisBase 242.0g冰醋酸 57.1mlEDTA o.5M PH 8.0 100ml去离子水定容至1000ml。10%APS； Ammonium persulfate 过硫酸铵 0.1g， 蒸馏水定容至1.0ml.2. 灌胶具体步骤见设备说明3. 点样缓冲液加热至60后准备点样。将45微升的PCR产物和5微升6loading buffer 混匀后加入上样孔。若PCR产物亮度一般，可加90微升PCR产物和10微升6loading buffer混合液。（微量进样器与色谱进样器相似）4. 电泳在1TAE缓冲液中（可加140m l50TAE加蒸馏水至7L），只开heat，不开pump，先在200V电压下，10min，是样品快速跑出泳道，以免把DNA吹出，然后打开pump，85V，60，电泳14h.2012-6-21 晴天二、变性梯度凝胶电泳胶制备1.将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。2.共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。3.在两个注射器上分别标记高浓度与低浓度，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。4.反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cmgels(1mmthick)：设体积调整装置到14.5。5.配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。三. 微藻生物群落多样性研究变性梯度凝胶电泳技术（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)是一种重要的分子多态性技术，在物种鉴定及浮游生物群落多样性研究方面有着广泛的应用。可以对多个样品同时进行分析，具有快速、简便、直观结果可靠、重现性好等特点，因此可以对环境中的微生物在时间和空间上的变化进行监测11。四. 变性梯度凝胶电泳胶制备121.将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。2.共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。3.在两个注射器上分别标记高浓度与低浓度，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。4.反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cmgels(1mmthick)：设体积调整装置到14.5。5.配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。配置剂量如下:试剂35%45%0%变性剂9.75ml,8.25ml 100%变性剂5.25ml,6.75mlAPS : 80l,80lTEMED:18l,18l注意在加入100%变性剂后，在高浓度的丙烯酰胺溶液中加入摇匀的ER燃料300l。以便于与低浓度的区分。1.加完后迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有高浓度的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。2.通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。3.分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确!再将注射器的聚丙烯管同Y形管相连。4.轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。5.小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。放入4冰箱中备用。6.迅速清洗用完的设备。2.2.2.4电泳过程1.电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60。2.移去顶部梳子之后，将相关设备和胶移至电泳槽内，使缓冲液高度刚刚没过胶上的加样孔。清洗点样孔。3.用注射针吸取40l样品点样。样品为第一步中获得的PCR产物与2x染色剂Loadingbuffer按照1:1比例混合而成的。4.200V,不开PUMP，电泳10min5.开PUMP，150V，电泳6h2.2.2.5染色拍照1.配置0.5g/mL溴化乙锭（EB）,配方为500mlH2O20mlEB2.电泳完毕，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘