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第 32卷 第 5期海 洋 学 报Vol 32 No 5 2010 年 9 月ACT A OCEANOLOGICA SINICASpetember 2010 半知菌 JYX 201 菌株 Penicillium griseof ulvum 对海洋污染重金属反应的研究 白树猛1 2 田黎1 2 史振平2 张久明2 姜会超2 1 国家海洋局 第一海洋研究所 山东 青岛 266061 2 青岛科技大学 生物系 山东 青岛 266042 收稿日期 2009 12 25 修订日期 2010 03 12 基金项目 国家 自然科学基 金 40776098 40976104 国 家高技术研 究发展计 划 八六三 计划 2007AA09Z435 2007AA091507 2008AA09Z407 作者简介 白树猛 1983 男 山东省泰安市人 硕士研究生 从事海洋微生物研究 E mail 通信作者 田黎 E mail wshw8 yahoo com cn 摘要 从胶州湾污染区域的沉积物样品中筛选获得 1 株对重金属元素反应敏感的菌株 经鉴定为灰 黄青霉 Penicillium griseof ulvum 对该菌株在重金属胁迫下的生物学特征及酶的活性变化进行 了研究 结果表明 一定量的重金属铜 锌离子对菌株产生显著的影响 并通过形态与色素变化的方 式表现出来 当培养基中 Cu2 浓度为 125 mg dm3 Zn2 浓度为 800 mg dm3时 孢子萌发会完全 受到抑制 同时菌丝也发生严重变异 菌株色素随着 Cu2 浓度的增加呈现从灰绿色到浅黄色的颜 色变化 随着 Zn 2 浓度的增加呈现从灰绿色到白色的颜色变化 在菌株生长的离子浓度范围内 一定量的 Cu2 浓度能提高 CAT GOD 酶的活性作用 在 Cu2 浓度为 25 mg dm3时活性作用最 强 在25 75 mg dm3时 随着 Cu2 浓度的增加 活性作用逐渐减弱 浓度增加至 100 mg dm 3时菌 丝不能生长 Cu 2 对菌体金属硫蛋白的影响不规则 在 Zn 2 浓度为 100 400 mg dm 3 的培养基 中 CAT GOD 酶和金属硫蛋白的活性作用随着 Zn 2 浓度的增加逐渐增强 在 Zn 2 浓度为 400 mg dm3时酶和金属硫蛋白活性达到最强 Zn2 浓度增加至 600 mg dm3时 菌株不能生长 关键词 近海重金属污染 指示半知菌 生物学变化 中图分类号 Q959文献标志码 A文章编号 0253 4193 2010 05 0127 08 1 引言 保护近岸海洋环境与防治污染是国家 十一五 重大规划 海洋污染元素众多 其中以重金属对生 物的影响较明显 重金属元素通过破坏细胞膜或抑 制细胞分裂导致生物生长出现异常甚至死亡 重金 属在海洋环境中沿生物链放大 最终累积在人类食 品中 对人类身体健康产生较大的潜在危害而倍受 关注 目前已建立理化监测方法 它能够较精确地 反映重金属含量 1 但不能确切反映污染物对环境 尤其对生物的综合效应 而生物监测则直接把污染 物与它们的毒性联系起来 其中指示生物法是较成 熟 有效的生物监测方法 其原理是通过指示生物 的生物学特性和生理生化变化来反映海洋污染的程 度 2 3 在已报道的指示生物中 微生物以取样方 便 反应灵敏 研究周期短 成本低等优势受到重视 在近年来国内外开展的研究中 以原核微生物发光 细菌和大肠杆菌作指示生物的研究较多见 4 而以 真核微生物真菌作指示生物的研究鲜见报道 5 真 核微生物与高等生物更接近 通过它们推测污染对 高等真核生物的影响更准确 2 3 半知菌门真菌是 一类较特殊的真菌 这类真菌适应性强 繁殖快 是 海洋环境中分布最广的真菌类型 半知菌的形态和 色素很丰富 周围环境的变化会引起其形态和色素 变化 金属硫蛋白 metallothionein MT 是一类 普遍存在于生物体内的低分子量可诱导型非酶蛋 白 该蛋白在转录水平上易被环境中的重金属所诱 导 而且这种诱导与重金属浓度具有相关性 可以反 映环境中的重金属浓度水平 是公认的评价重金属 污染状况的关键性生物标志物 污染重金属的胁迫 作用也会引起其防御系统的变化 过氧化氢酶 CAT 与葡萄糖氧化酶 GOD 是最直接的反应指 标 6 7 课题组从青岛胶州湾污染较重的李村河入 海口 海泊河入海口沉积物样品分离半知菌的优势 种 并根据菌株对重金属元素 Cu Zn Hg 的反应 筛选获得 1株 JYX 201 菌株 分别对菌株在重金属 胁迫下的生长 色素及 CAT GOD 酶活变化进行了 研究 以证明该菌株作为污染指示菌株的可能性 2 材料与方法 2 1 重金属元素离子浓度 根据青岛胶州湾污染较重的李村河入海口 海 泊河入海口沉积物金属元素 Cu Zn Hg 的平均 浓度 设定金属元素离子的浓度 Cu2 浓度为 0 25 50 75 100 125 mg dm 3 Zn 2 的浓度为 0 100 200 400 600 800 mg dm 3 Hg2 的浓度为 0 0 5 1 2 3 4 mg dm3 2 2 培养基 海水PDA 培养基 改良的沙氏培养基 8 用于半 知菌的培养与检测 2 3 菌株选择与鉴定 从上述 2 个河口及对照区海域 17 个采样点的 海洋沉积物样品中分离得到 120 余株半知菌菌株 先选出分布率占 80 以上的 8 株菌株作为优势种 根据色素情况选出的 4 株分别为产黄色素的 JSX 101 产黑色素的 JSX 301 产青绿色素的 JSX 302 产灰绿色素的 JYX 201 根据这 4 株菌株对重金属 元素 Cu Zn Hg 的反应 筛选获得 1 株对 Cu2 Zn 2 反应较敏感的 JYX 201 菌株 采用形态与分子 生物学方法鉴定其种类 2 3 1 生物学特性 取少量海水 PDA 固体培养基滴加在灭菌载玻 片上 将 JYX 201 菌株接种在培养基表面 在 25 培养 4 d 后 放置于显微镜上 观察菌株自然生长的 立体结构 并刮取少量菌落 放置于载玻片上 用常 规方法观察菌株产孢结构 2 3 2 ITS 序列测试与系统发育树建立 对菌株 JYX 201 采用玻璃珠法 9 提取基因组 DNA 并采用真菌核糖体内转录间隔区 ITS 序列通 用引物 ITS1 IT S4 进行 PCR 扩增 由上海博尚生 物技术有限公司完成测序工作 将该菌的 ITS 序列 在NCBI 网站 http www ncbi nlm nih gov 上 进行同源性比较 BLAST 采用邻接法 10 构建其 与相关菌株的 IT S 序列系统发育树 2 4 菌株孢子萌发测定 将 JYX 201 菌株接种在海水 PDA 固体培养基 上 在 25 培养 7 d 收集分生孢子 过滤除去菌体 混悬在 30 mL 无菌水中 得到孢子悬浮液 调整浓 度为 106个 mL 采用凹玻片悬滴法 11 将菌株的 孢子悬浮液接种在含不同元素离子浓度的沙氏培养 液中 以未加金属元素的同种培养基作为空白对照 CK 观察孢子生长和菌丝形态变化 以孢子芽管 菌丝长度超过孢子长度的 1 2 作为萌发标准 统计 萌发孢子数量 计算真菌孢子萌发率 对实验数据采 用 SPSS 进行方差分析 采用 Duncan 的多重比较法 来分析不同元素离子浓度对菌株孢子萌发的差异显 著程度 2 5 菌落生长变化测定 在含不同元素离子浓度的改良的沙氏固体培养 基的平板上分别接入 JYX 201 孢子液 30 L 用玻 璃涂布器涂抹均匀 在25 培养4 d 观察菌落生长 速度变化和菌落颜色变化 2 6 菌株防御酶活性测试 将菌株 JYX 201 斜面菌种接入海水 PDA 液体 培养基中 在 25 以 150 r min 离心培养 24 h 按 10 接种量接入灭菌后含不同浓度的元素离子的海 水 PDA 液体培养基中 以未加金属元素的同种培 养基作为空白对照 CK 在同样条件下培养 48 h 后过滤收集菌体 将菌体研磨破壁 以 4 000 r min 离心 10 min 取上清液供酶活测试 对葡萄糖氧化 酶 GOD 的活性采用 2 4 二氯苯酚氧化法测定 12 对过氧化氢酶 CAT 采用紫外分光光度法测定 13 菌株金属硫蛋白活性的测定方法见文献 14 3 结果 3 1 菌株形态和系统发育学鉴定结果 菌株在海水 PDA 固体培养基培养 4 d 后 菌落 呈灰绿色 绒毛状 局限生长 培养基背面呈褐色 在显微镜下观察 分生孢子梗顶端排列成帚状间枝 分生孢子呈浅灰褐色 球形或卵圆形 在分生孢子梗 上排列成念珠状 菌株 JYX 201 的 ITS 序列在 GenBank 经同源 128海洋学报 32 卷 性检索结果显示 登录号EU888291 该菌与 Pen icillium griseof ulvum Penicilliumglandicola Penicillium chrysogenum 等种的同源性最高 相似 率达到 99 挑取 10 个菌株的 ITS 序列与菌株 JYX 201 采用邻接法 neighbor joining 构建系统发 育树 图 1 从图1 看出 菌株 JYX 201 与Penicilli um griseof ulvum 登录号 DQ339557 关系最近 结合 生物学特性及 ITS 序列分析 确认菌株 JYX 201属于 灰黄青霉 Penicillium griseof ulvum 图 1菌株 JYX 201 系统发育树 3 2 不同浓度的重金属离子对孢子萌发的影响 3 2 1 Cu2 对孢子萌发的影响 JYX 201 菌株在未加金属元素的空白对照沙氏 培养液中培养 12 h 87 以上的孢子都可萌发 加 入不同浓度 Cu2 在一定的时间内会对萌发起抑制 作用 当 Cu2 浓度为 25 mg dm 3 时 萌发基本与对 照的相似 随着 Cu 2 浓度上升 孢子萌发率逐渐下 降 图 2 当 Cu2 浓度为 100 mg dm3时 12 h 时 孢子萌发率降低为 21 Cu2 浓度增加到125 mg dm 3 孢子萌发完全受到抑制 利用 SPSS15 0 软件对离子浓度和培养时间作 方差分析 Cu2 离子浓度和培养时间的 F 值分别为 7 551 和 61 982 出现概率均小于极显著性水平 0 05 具有统计学意义 说明 Cu 2 离子浓度和培养 时间都对孢子萌发起到显著的影响作用 采用 Duncan 的多重比较法分析 Cu2 浓度对孢 子萌发的影响 结果见表 1 Subset 值越大 表明孢 子萌发的效果越好 对照 Subset 值最大 孢子的萌 发效果最好 添加的 Cu2 浓度越大 Subset 值越小 孢子萌发的效果越差 图 2Cu2 Zn2 浓度 mg dm3 对萌发率的影响 Cu2 对孢子芽管增长也有抑制作用 对照的 芽管增长最快 离子浓度越大 芽管增长越慢 在浓 度为 50 mg dm 3 时 培养 12 h 芽管的长度约为对 照的 1 2 浓度增加到 125 mg dm 3 培养 40 h 芽 管的长度不及对照的 1 10 受较高浓度 Cu2 抑制 影响的芽管发育成菌丝 也发生不同程度的变异 菌 丝局部肿胀 出现不规则的分枝 分枝短小 在后期 形成微核体 见图 3 表 1不同 Cu2 浓度对孢子萌发率的方差分析 Cu2 浓度 mg dm 3 样本数 Subset 123 100647 667 75657 333 50660 66760 667 25672 66772 667 CK678 500 1295 期 白树猛等 半知菌 JYX 201 菌株 Penicillium griseof ulvum 对海洋污染重金属反应的研究 3 2 2 不同浓度的 Zn 2 对孢子萌发的抑制作用 低浓度 Zn2 对 JYX 201 菌株的孢子萌发具有 促进作用 当 Zn2 浓度为 100 mg dm3时 孢子萌 发效率高于对照的 随着 Zn 2 浓度上升 孢子萌发 开始受到抑制 萌发率逐渐下降 见图 2 当 Zn2 浓度为 400 mg dm 3 时 培养 12 h 萌发率 仅为 43 Zn2 浓度增加到 800 mg dm3时 孢子萌发 完全被抑制 图 3受 Cu2 影响的菌丝及产生的微菌核 利用 SPSS15 0 软件对离子浓度和培养时间作 方差分析 Zn2 离子浓度和培养时间的 F 值分别为 28 093 和 21 249 出现概率均小于极显著性水平 0 05 具有统计学意义 说明 Zn 2 离子浓度和培养 时间都对孢子萌发起到显著的影响作用 从表 2 中可以看出 Zn2 浓度为 100 mg dm3时 Subset 值最大 孢子的萌发效果最好 添加的 Zn 2 浓度越高 Subset 值越小 孢子萌发的效果越差 表 2不同 Zn2 浓度对孢子萌发率的影响 Cu2 浓度 mg dm 3 样本数 Subset 231 600611 8333 400650 666 7 200673 333 3 CK678 500 0 100682 500 0 Zn 2 对孢子芽管增长也有不同影响 Zn 2 浓 度为 100 mg dm 3时 孢子芽管生长最快 随着离子 浓度增加 芽管增长逐渐减慢 而且形状扭曲增粗 Zn2 浓度增加到 800 mg dm3时 芽管增长完全被 抑制 低浓度的 Zn 2 对芽管发育成的菌丝影响不 大 受高浓度 Zn 2 影响的菌丝发生不同程度的变 异 浓度为 400 mg dm3时 菌丝变形明显 菌丝变 粗扭曲 表面出现无规则突起 浓度为 600 mg dm3 时 菌丝的发生量更少 产生畸形无规则的分生孢子 梗 形成大量的微核体 无分生孢子形成 3 3 重金属对菌落生长的影响 3 3 1 Cu 2 的影响 菌株JYX 201在加入不同浓度 Cu2 的海水PDA 培养基上培养5 d 后 菌落及色素变化见图 4 对照 的菌落颜色变为灰绿色 加入 25 mg dm 3 浓度的 Cu 2 菌落色素变为浅灰绿色 Cu 2 浓度为75 mg dm3时 菌落颜色变为黄褐色 Cu2 浓度为 100 mg dm3时 颜色变为浅褐色 增加到 125 mg dm3 菌落颜 色变为浅黄色 即菌株的色素随着 Cu 2 浓度的变化 呈现较明显的变化 显示良好的指示作用 图 4Cu2 Zn2 对菌落的影响 130海洋学报 32 卷 3 3 2 Zn 2 的影响 菌株 JYX 201 在加入不同浓度 Zn2 的海水 PDA 培养基上培养 5 d 后 菌落及色素变化见图 4 对照的菌落颜色为灰绿色 加入 200 mg dm 3 浓度 的 Zn 2 培 养基 颜 色 变 为褐 色 Zn 2 浓度 为 400 mg dm3时 菌落生长速度降低 培养基颜色变 为红褐色 Zn2 浓度为 600 mg dm3时 培养基中 只长出少量白色菌落 当浓度增加到 800 mg dm 3 时 菌株停止生长 从图 4 看出 Zn2 对菌株生长 的影响没有 Cu2 的敏感 在低浓度 Zn2 的培养基 中 菌株的菌落没有明显变化 只在培养基上出现颜 色变化 当浓度增加到 600 mg dm 3 时 菌株形态 才出现显著变化 菌落色素变为白色 在较高浓度 Zn2 范围内 菌株的色素与生长状况显示指示 作用 3 4 菌株酶活性测定结果 JYX 201 在加入不同金属离子的海水 PDA 液 体培养基中培养 对金属离子的增长反应较敏感 随 着离子浓度的增加 生长量逐渐减少 当 Cu2 浓度 为 100 mg dm 3 Zn2 浓度为 600 mg dm 3 时 菌株 在液体培养基上停止生长 在这一浓度范围内 菌株 的 GOD 和 CAT 的活性变化如图 5 所示 图 5JYX 201 在不同浓度 Cu2 Zn2 作用后的 GOD 和 CAT 的活性 3 4 1 Cu 2 对酶活性的影响 从图 5可看出 GOD 酶的活性所对应的吸光度 值变化曲线呈现先上升后下降的趋势 根据吸光度 值与 GOD CAT 酶的活性的相关性研究 15 16 表 明 其变化与 2 种酶的活性变化相关性较强 浓度 为 25 mg dm3的 Cu2 对 GOD CAT 酶的活性作用 最强 随着离子浓度的增加 酶活作用逐渐减弱 GOD酶活下降较平缓 CAT 酶的活性作用变化起 伏较大 与对照相比 菌株的 GOD 酶的活强度随 着 Cu2 的增加呈现逐步减弱的趋势 3 4 2 Zn2 对酶活的影响 Zn2 对 GOD CAT 酶的活性作用呈现出与 Cu2 不同的变化趋势 经不同浓度 Zn2 的处理 GOD酶的活性所对应的吸光度值都小于对照值 变 化曲线呈现逐步下降的趋势 Zn2 对 CAT 酶的活 性影响的变化曲线为先上升再下降 与对照相比 随着 Zn 2 离子浓度的增加 酶的活性作用逐渐增 强 400 mg dm 3的 Zn2 对 GOD CAT 酶的活性作 用最强 即较高浓度的 Zn2 会对菌株的酶的活性 产生较明显的影响 3 4 重金属对菌株硫蛋白的影响 从图 6 中可看出 随着培养基中 Cu 2 浓度的增 加 JYX 201 体内金属硫蛋白所对应的吸光度值快 速上升 Cu2 浓度为 25 mg dm 3 时 吸光度值达 0 991 之后稍微下降 接着又上升 经过脱金属处 理后 与之对应的菌体提取液的吸光度值都下降 在 Cu2 浓度为 25 mg dm3时吸光度值最小为 0 372 Zn 2 对菌体内金属硫蛋白的作用与 Cu 2 不 同 随着 Zn 2 浓度增高 菌体金属硫蛋白所对应的 吸光度值不断增高 同时经过脱金属处理后的菌体 提取液的吸光度值也逐步上升 随着 Zn2 浓度越 来越 高 菌 体 内 金 属 硫 蛋 白 活 性 越 来 越 强 400 mg dm 3浓度的 Zn2 对金属硫蛋白的作用最 强 其吸光度值为 0 911 与之对应的脱金属处理后 的吸光度值为 0 822 当 Zn2 浓度达 600 mg dm3 时 菌株不能生长 1315 期 白树猛等 半知菌 JYX 201 菌株 Penicillium griseof ulvum 对海洋污染重金属反应的研究 图 6 JYX 201 在不同浓度的 Cu2 Zn2 条件下金属硫蛋白与硫蛋白的活性 A 金属硫蛋白 B 脱金属后的硫蛋白 4 讨论 伴随经济的发展和人口的增长 在生产和生 活过程中产生的废弃物也越来越多地直接或间接 地进入海洋 由此产生海水环境条件恶化 引发海 洋服务功能显著下降 可持续利用能力加速丧失 已经引起国家和有关地方政府的高度重视 并在 十一五 做为重大规划实施 在海洋环境保护与 治理过程中 生物监测将发挥越来越重要的作用 海洋污染元素众多 重金属元素是分布最普遍 对 生物影响较大的一类污染物 本文选择生命模型 与高等动物相类似的真核微生物 海洋半知 菌 作为指示生物 在国内外均未查到类似的 研究 半知菌是海洋中分布最广的一类真菌 不但材 料易得 而且个体较大 形态变化容易观察 还能产 生肉眼可见的丰富的色素 污染元素的胁迫作用会 引起其形态 色素及防御系统的变化 17 从理论上 说具有作为指示生物较好的优势 为了验证这种可 能性 课题组从分离到的菌株中筛选出 4 株在污染 海域分布较普遍 菌落颜色鲜艳的菌株 通过比较它 们对金属元素的反应 确定 1 株反应较敏感的 JYX 201菌株 将该菌株在 Cu Zn H g 金属元素离子的 不同浓度的培养基上进行培养观察 发现菌株在加 入 Cu2 Zn2 的培养基中随着 2 种元素浓度的变 化 色素和形态会发生较明显的变化 显示良好的指 示作用 加入 Hg 元素对菌株生长没有明显影响 其原因可能是采样海域的 Hg2 污染较轻 根据污 染沉积物设定的 Hg 2 浓度较低 而且报道的水体 环境中对生物毒性较大的是甲基汞 加入的 H g 2 并没有经微生物代谢成甲基汞 而 Hg2 对微生物 毒性小 作为真核生物的一个类群 逆境可能引起半知 菌防御酶发生变化 由于酶的活性变化比形态变化 更敏感 抗氧化防御系统作为分子生态毒理指标曾 引起有关研究者的关注 曾丽璇等 18 以河蚬作为指 示生物 探讨以过氧化氢酶活性作为重金属污染监 测指标的可能性 结果显示在重金属镉 铜的浓度为 50 150 g dm3时 可以选择过氧化氢酶活性作为 监测镉 铜污染的有效生物标记 本文通过测试半 知菌葡萄糖氧化酶 GOD 过氧化氢酶 CAT 金 属硫蛋白 MT 的变化 认为在 Cu2 Zn2 的作用 下 JYX 201 菌株的防御酶活性和重金属污染评价 关键性标志物金属硫蛋白 19 变化都呈现一定的指 示作用 与形态学特征结合 可以作为良好的生物指 示标记 海洋半知菌做为污染指示生物的设想是可行 的 为了使测试结果更敏感 更准确 有关利用该 菌特异 IT S 序列作为监测探针的方法正在进行 研究 参考文献 1 T EGLER B SHARP M JOHNSON M A Ecological monitoring and assessment network s proposed core monitoring variables an early warning of environmental change J Environmental Monitoring and Assessment 2001 67 29 56 132海洋学报 32 卷 2 VERLECAR X N DESAI S R SARKAR A et al Biological indicators in relation to coastal pollution along Karnataka coast India J Water Research 2006 40 17 3304 3312 3 GIANNA C CECILIA S EMANUELA S T he use of bio indicators for quality assessments of the marine environment examples from the M editerranean Sea J Journal of Coastal Conservation 2002 8 2 147 156 4 KLOOT R W RADAKOVICH B HUANG X Q et al A comparison of bacterial indicators and methods in rural surface waters J Environmental Monitoring and Assessment 2006 121 273 285 5 RESH V H Which group is best Attributes of different biological assemblages used in freshwater biomonitoring programs J Environ mental Monitoring and Assessment 2008 138 131 138 6 王丽平 郑丙辉 孟伟 重金属 Cu 对两种海洋微藻的毒性效应 J 海洋环境科学 2007 26 1 6 9 7 刘建忠 杨慧英 赵继伦 等 葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶的生物合成 J 中山大学学报 自然科学版 1998 37 1 68 72 8 温占波 裴月湖 田黎 海洋微生物产抑真菌 抑肿瘤次生代谢产物的初步研究 J 中国海洋药物 2003 22 6 6 9 9 MELO S C PUNGARTNIK C CASCARDO J C et al Rapid and efficient protocol for DNA extraction and molecular identification of the basidiomy cete Crinip ellis perniciosa J 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in polluted coastal areas BAI Shu meng 1 2 T IAN Li1 2 SH I Zheng ping2 ZHANG Jiu ming2 JIANG Hui chao 2 1 First Institute of Oceanograp hy State Oceanic A dministration Qingdao 266061 China 2 Biological Department Qing dao University of Science and T echnology Qingdao 266042 China Abstract A strain sensitive to heave metals was isolated from contaminated sediments of the Jiaozhow Bay coast and identified as Penicillium griseo