第五章 卫生指标菌的检测OK.ppt

第五章卫生指标细菌的检验 2020年1月31日星期五 2 第一节食品中菌落总数的测定 2020年1月31日星期五 3 一 菌落总数 概念 是指食品检样经过处理 在一定条件下培养后 单位质量 g 容积 mL 或表面积 cm2 内所形成的好氧或兼性厌氧细菌菌落的总数 是活菌计数 需氧菌数 不代表实际所有的细菌总数 2020年1月31日星期五 4 二 菌落总数测定的意义 1 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量 2 了解细菌在食品中的繁殖动态 3 预测食品贮藏期限的长短 2020年1月31日星期五 5 三 菌落总数测定的方法 平板倾注法 平板表面涂布法平板表面点滴法 2020年1月31日星期五 6 四 平板倾注法测定菌落总数GB4789 2 2010 原理 样品经过稀释后 使样品悬液中的细菌分期存在 接种一定量 一般为1mL 到培养基中 再加入适量的培养基 充分混匀 从理论上讲 微生物在培养基中分散呈单个存在 一个菌体长出一个肉眼可见的菌落 2020年1月31日星期五 7 检验步骤 程序 2020年1月31日星期五 8 一 样品稀释及做平板 1ml 1ml 1ml 1ml 1 10 1 1000 1 100 1 10000 1ml 1ml 1ml 加入46 营养琼脂15 20mL 25g ml样品 生理盐水 2020年1月31日星期五 9 一 样品稀释及做平板 2020年1月31日星期五 10 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min 以防止细菌有所死亡或繁殖 2020年1月31日星期五 11 二 培养 倒放平板普通食品 36 1 48h 2h水产品 30 1 72h 3h 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时 可在凝固后的平板计数琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基 约4mL 凝固后翻转平板 按上步条件进行培养 2020年1月31日星期五 12 三 计数和报告 到达规定培养时间 应立即计数 如果不能立即计数 应将平板放置于0 4 但不得超过24h 2020年1月31日星期五 13 1 菌落的选择 1 单个菌做一个菌落计 2 呈链状生长的菌落之间无任何明显界限 作为一个菌落计 如存在有几条不同来源的链 则每条链均应按一个菌落计算 3 如片状菌落不到平板一半 而另一半又分布均匀 则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数 2020年1月31日星期五 14 2 平板菌落计数的选择 1 选取菌落数在30 300之间的平板 SN标准要求为25 250个菌落 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内 计算两个平板菌落数的平均值 再将平均值乘以相应稀释倍数 作为每g mL 样品中菌落总数结果 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时 按公式 1 计算 2020年1月31日星期五 15 式中 N 样品中菌落数 C 平板 含适宜范围菌落数的平板 菌落数之和 n1 第一稀释度 低稀释倍数 平板个数 n2 第二稀释度 高稀释倍数 平板个数 d 稀释因子 第一稀释度 2020年1月31日星期五 16 注意 旧版标准的做法为 比值小于或等于2取平均数 比值大于2则其较小数字 2020年1月31日星期五 17 2 如均大于300 则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告 3 如均小于30 则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告 4 如菌落数有的大于300 有的又小于30 不在30 300之间 以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告 5 如所有稀释度均无菌落生长 则应按小于1乘以最低稀释倍数报告 2020年1月31日星期五 18 3 菌落数的报告 菌落数在1 100时 按 四舍五入 原则 以整数报告 如大于100时 则报告前面两位有效数字 第三位数按四舍五入计算 固体检样以克 g 为单位报告 CFU g 液体检样以毫升 mL 为单位报告 CFU mL 表面涂擦则以平方厘米 cm2 报告 CFU cm2 2020年1月31日星期五 19 2020年1月31日星期五 20 四 检验注意事项 1 对照平板出现几个菌落时 要追加对照平板 2 吸管进出瓶子或试管时 吸管口不得触及瓶口 管口的外围部分 3 吸管插入试样液内的深度不得小于2 5cm 调整时要使管尖与容器内壁紧贴 4 进行稀释时 吸管口不得与稀释液接触 5 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min 2020年1月31日星期五 21 6 为防止细菌增殖产生片状菌落 在检液加入平皿后 应在20min倾入琼脂 并立即使之与琼脂混合均匀 在平面上先左右摇动 后顺时针和逆时间旋转 7 加入平皿内的检样稀释液有时带有检样颗粒 需加做平皿放在4 的环境中 以便计数时排除颗粒的影响 8 稀释倍数愈高菌落数愈少 稀释倍数愈低菌落数愈多 如出现逆反现象 不可作为检样计数报告的依据 四 检验注意事项 2020年1月31日星期五 22 复习题 1 什么是菌落总数 2 测定食品 饮料等产品的菌落总数有什么意义 3 画出平板倾注法测定菌落总数的示意图 4 在测定菌落总数时 如何选择菌落进行计数 5 在菌落总数的检验中 要注意哪些事项 6 在菌落总数的检验中 如何根据样品的特性选择培养温度和时间 2020年1月31日星期五 23 第二节食品中大肠菌群的检验 2020年1月31日星期五 24 一 大肠菌群 1 什么是大肠菌群 指一群在37 能分解乳糖产酸 产气 需氧及兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌 2 大肠菌群的组成 大肠埃希氏菌属 柠檬酸杆菌属 肠杆菌属 又叫产气杆菌属 包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌 克雷伯氏菌属的一部分和沙门氏菌属的第III亚属 2020年1月31日星期五 25 2020年1月31日星期五 26 1 粪便污染的指标菌 可作为粪便污染的指标有 大肠杆菌 粪链球菌 产气荚膜梭菌 大肠杆菌更适合作为指标菌 但该菌群可因环境而导致菌型的改变 大肠杆菌检验方法繁杂 且并不确切 大肠菌群是更合适的指标菌 二 大肠菌群检验的卫生学意义 2020年1月31日星期五 27 2 以大肠菌群作为粪便指标菌原因 在粪便中数量最大 在外环境中存活的时间与致病菌大体相同 检测方法简便容易 二 大肠菌群检验的卫生学意义 2020年1月31日星期五 28 1 判断食品中否受到粪便污染 2 有利于控制肠道传染病的发生和流行 3 有利于控制食品在生产加工 运输 保存等过程中的卫生状况 3 大肠菌群检验的意义 二 大肠菌群检验的卫生学意义 2020年1月31日星期五 29 三 大肠菌群的生物学特性 1 形态与染色 革兰氏染色阴性 无芽胞杆菌 2 发酵乳糖产酸产气 3 培养特性 在EMB琼脂上的典型菌落 呈深紫黑色或中心深紫色 圆形 稍凸起 边缘整齐 表面光滑 常有金属光泽 在麦康凯琼脂上的典型菌落 呈桃红色或中心桃红 圆形 扁平 光滑湿润 2020年1月31日星期五 30 EMB平板照片及原理 呈深紫黑色或中心深紫色 圆形 稍凸起 边缘整齐 表面光滑 常有金属光泽 2020年1月31日星期五 31 麦康凯琼脂平板Ageofcultureis24h 呈桃红色或中心桃红 圆形 扁平 光滑湿润 2020年1月31日星期五 32 四 大肠菌群检验方法及操作方法 国家标准 2003版 三步法 乳糖胆盐发酵试验 分离培养 证实试验 乳糖发酵试验 行业标准 两步法 推测试验 证实试验国家标准 2010版 两步法 LST发酵 BGLB复发酵 2020年1月31日星期五 33 GB4789 3 2010 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 LaurylSulfateTryptose LST 肉汤 煌绿乳糖胆盐 BrilliantGreenLactoseBile BGLB 肉汤 2020年1月31日星期五 34 大肠菌群检验中常用的抑菌剂 胆盐 洗衣粉 SDS 煌绿 结晶紫 孔雀绿等 我国常用胆盐作为抑菌剂 猪 牛 羊3种胆盐检验效果无差别 3号胆盐 混合胆盐 去氧胆酸钠 兔胆盐会影响大肠菌群的检验结果 用量 品牌 规格会影响结果 2020年1月31日星期五 35 MPN法简介TheMostProbableNumberMethod 2020年1月31日星期五 36 2020年1月31日星期五 37 检样 稀释处理 EMB等 革兰氏染色 乳糖发酵管 革兰氏阴性无芽胞 产气 革兰氏阳性 大肠杆菌阴性 大肠杆菌阴性 报告 不产气 乳糖胆盐发酵管 产气 不产气 大肠杆菌阴性 报告 报告 报告 大肠杆菌阳性 三步法简介 2020年1月31日星期五 38 1 100 1 10 各加入1ml 各加入10ml 各加入1ml 单料乳糖胆盐发酵管 单料乳糖胆盐发酵管 双料乳糖胆盐发酵管 初发酵 检样稀释 检样量1g ml 检样量0 1g ml 检样量0 01g ml EMB 分离培养 证实试验 乳糖发酵管 镜检 查MPN表报告结果 2020年1月31日星期五 39 第三节粪大肠菌群的检验 粪大肠菌群 是大肠菌群的一种 又称为耐热大肠菌群 是指一群需氧及兼性厌氧 在44 5 培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌 2020年1月31日星期五 40 表1粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征 2020年1月31日星期五 41 粪大肠菌群检验程序 2020年1月31日星期五 42 2020年1月31日星期五 43 1 从制备样品匀液至稀释完毕 全过程不得超过15min 2 对产酸但未看到气泡的乳糖发酵 用手轻打动试管 如有气泡沿管壁上浮 应考虑可能有气体产生 应作进一步试验 3 不可用其他胆盐代替指定的胆盐 六 检验注意事项 2020年1月31日星期五 44 第四节食品中大肠杆菌计数 大肠杆菌 Escherichiacoli 学名大肠埃希氏菌 被归为肠杆菌科 属于埃希氏菌属 革兰氏阴性短杆菌 能在44 5 发酵乳糖 产酸 产气 IMViC生化试验为 或为 2020年1月31日星期五 45 大肠杆菌检验的卫生学意义 多数为肠道正常菌群 并产生有益的作用 直到20世纪中叶 才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性 它们能引起食物中毒 统称为致病性大肠杆菌 大肠杆菌学用作受粪便污染的重要指标 存活时间与一些常见的肠道病原菌接近 它们的出现可能预示首某些肠道疾病的病原菌存在 如志贺氏菌 沙门氏菌等 2020年1月31日星期五 46 检验程序 靛基质 I 甲基红 M VP Vi 柠檬酸盐 C 2020年1月31日星期五 47 2020年1月31日星期五 48 复习题 1 什么是大肠菌群 大肠菌群由哪些微生物组成 2 测定食品 饮料等产品的大肠菌群数有什么意义 3 大肠菌群具有哪些生物学特性 4 在大肠菌群数的检验中 要注意哪些事项 5 在水的大肠菌群数检验中 如何进行水样的采集 2020年1月31日星期五 49 第五节大肠菌群快速检验 食品大肠菌群快速检验方法 LTSE法TTC显色法 DC试管法 纸片法 2020年1月31日星期五 50 一 LTSE法 LTSE培养基 Lactose Tryptone SodiumDodecylsulfate TraceElements LTSE P180原理 不同细菌以不同的途径分解糖类 在其代谢过程中产生了丙酮酸及转变为各种酸类 大肠菌群能分解乳糖 由于具有甲酸解氢酶作用于甲酸 产生H2和CO2气体 因此气体的产生是在产酸的同时进一步分解酸而形成的 据次将样品接种到LTSE培养基肉汤内15h 观察有无气体产生 然后加氧化酶试验和涂片革兰色镜检结果综合判断是否有大肠菌群的存在 2020年1月31日星期五 51 LTSE检验程序 P178 2020年1月31日星期五 52 二 TTC法 氯化三苯四氮唑快速显色法 P181 2020年1月31日星期五 53 三 DC法 去氧胆酸钠半固体法 P183 185 2020年1月31日星期五 54 四 纸片法 P185 186 2020年1月31日星期五 55 一 食品饮料大肠菌群快速检验纸片 使用方法 1 样品稀释同国标法2 接种 饮料和饮用水采用原液 1 10 1 100三个稀释度 固体食品采用1 1 1 10和1 100三个稀释度 用1mL灭菌吸管吸取1mL同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上 做三个重复 2020年1月31日星期五 56 3 培养 将接种好的纸片轻轻压平 可叠放 在36 下培养15 24h观察结果 4 结果判定 纸片上出现紫红色斑点 其周围有黄圈者 为阳性 纸片为一种着色 无菌落生长者为阴性 纸片呈紫兰色 有紫红色斑点 其周围地黄圈者阴性 酸性食品接种后 纸片变黄 经培养后无紫红色斑点为阴性 2020年1月31日星期五 57 二 餐具大肠菌群快速检验 纸片法 使用方法 1 采样6 10份 碗 盘 杯等每份贴纸片两张 用无菌生理盐水湿润纸片后 立即贴于食具内侧表面 30s后取下 置于原塑料袋内 筷子以5只为一份样品 用吸管吸取生理盐水湿润纸片后 立即将筷子进口端 约5cm 抹拭两张 放入原塑料袋内 2020年1月31日星期五 58 2 将已采样的纸样置于37 C培养15h 纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性 纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点 但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性 同一份样品两张纸片均是阴性为合格 2020年1月31日星期五 59 食品冷饮大肠菌群检验纸片冷饮 乳制品和调味品等大肠菌群的测定 2020年1月31日星期五 60 食品饮料大肠菌群快速检验纸片饮料 食用纯水和糕点的大肠菌群测定 2020年1月31日星期五 61 餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效果检测 2020年1月31日星期五 62 大肠菌群测试片适用于需要对大肠菌群准确计数的样品 如消毒牛乳 冷饮和调味品等 2020年1月31日星期五 63 实例 水的大肠菌群检验 2020年1月31日星期五 64 一 水样的采集 1 自来水 未含氯 龙头火烧灭菌 畅流5 10 后取样 2 地面水源水 江湖河 水库 水池等 浸入水下20cm下取样 水井50cm下取样 3 漂白粉处理的水样 自来水 游泳池水 应在瓶内加入0 03g硫代硫酸钠 500ml 或2ml1 5 硫代硫酸钠液 500ml 除氯 4 运送 2小时内送到检验室 6 10 6h 立即检验 5 检验前 将水样振摇5 10分钟 202