乌鸡和家鸡血清成分分析——生化论文.doc

乌鸡和家鸡血清成分分析摘要: 实验通过邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇的含量进行定量测定，通过盐析、透析、醋酸纤维素薄膜电泳法将血清清蛋白与-球蛋白进行分离与鉴定，可知血清中有清蛋白、1、2、五种蛋白质，同时我们还对血清中的谷丙转氨酶活性进行鉴定及其活力单位的测定。关键词:血清 胆固醇 清蛋白与-球蛋白 谷丙转氨酶 生化分析前言：血液凝固析出的淡黄色透明液体即为血清，由于其不易凝集，所以用它进行生化实验分析。血清中含有各种基本营养物质（氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物）、激素（胰岛素、肾上腺皮质激素）、生长因子（成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子）、结合蛋白（白蛋白、转铁蛋白）等，正确分析其生化成分有利于了解其各种功能，比如它如何提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤还有对培养中的细胞起到某些保护作用。1 材料与方法：1.1 实验材料：乌鸡和家鸡血清1.2 实验方法：1.2.1 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇：胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用。产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。1.2.2 盐析法分离提纯蛋白质：球蛋白不溶于半饱和的（NH4）2SO4溶液，-球蛋白不溶于1/3饱和度的(NH4)2SO4溶液，而清蛋白仅不溶于饱和的（NH4）2SO4溶液。因而。可以利用不同浓度的（NH4）2SO4溶液使血清或其他混合蛋白质中的这些不同的蛋白质分开。1.2.3 透析法脱盐与蛋白质浓缩：透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。由于NH4+和SO42-可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐。利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。1.2.4 醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白：醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维素薄膜是用二乙酸纤维素制成的，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅为120m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为取代电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用广泛、没有吸附等特点。1.2.5 凝胶过滤层析：凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。1.2.6 纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用：观察肝糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肝糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。1.2.7 分光光度法测定血清丙转氨酶的活力：用丙氨酸和-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数1.3 实验器材：1.3.1 台秤 吸管 剪刀 滤纸 试管及试管架 分光光度计 电热恒温水浴锅 电子分析天平电炉 玻璃漏斗 研钵（两个） 三角烧瓶分光光度计 坐标纸 凝胶柱 速离心机 玻璃棒 大培养皿（以下仪器都需多种规格）量筒锥形瓶 容量瓶 刻度吸管 微量进样器 烧杯2 实验结果：2.1 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇2.1.1 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇标准曲线的绘制编号试剂编号编号编号编号编号01234标准胆固醇应用液/mL00.10.20.30.4醋酸/mL0.40.30.20.10邻苯二甲醛试剂/mL0.20.20.20.20.2蒸馏水/mL0.010.010.010.010.01混合酸/mL4.04.04.04.04.0100mL血清中总胆固醇含量/mg0100200300400A550nm0.0000.2050.3670.5610.6682.1.2 胆固醇含量 类型数据乌鸡家鸡吸光度0.1620.243胆固醇含量（100ml/mg）82.47130.122.2 凝胶过滤层析实验结果1.洗脱曲线例子溶质数溶液体积实际洗脱曲线2.3 醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的实验结果1.全血清电泳图谱2.血清清蛋白电泳图谱3.-球蛋白电泳图谱2.4 纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用2.5 分光光度法测定血清丙转氨酶的活力试 剂对照管测定管012345丙酮酸钠标准液（mL）0.050.100.150.200.25GPT基质液（mL）0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.100.100.100.100.10充分摇匀后，置于37水浴，保温10min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.500.500.500.500.50充分摇匀后，置于37水浴，保温20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.005.005.005.00充分摇匀后，室温静置30min后，520nm波长下比色A520nm值相当丙酮酸含量（mol）0.100.200.300.400.50相当GPT单位（100mL）100200300400500以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。 类型数据乌鸡家鸡吸光度0.1240.079100ml血清中谷丙转氨酶的活力单位75.6549.183 实验讨论：3.1胆固醇含量的测定实验结果表明：乌鸡的胆固醇含量比家鸡低。胆固醇可转化为脂肪，若是不喜欢肥胖的人食用鸡时可以选择乌鸡，营养价值没变的基础上可降低胆固醇的摄入。乌鸡的谷丙转氨酶的活力也比家鸡高，谷丙转氨酶与蛋白质代谢有密切的关系，乌鸡体内的谷丙转氨酶活性较高说明乌鸡体内蛋白质代谢较旺盛。3.2凝胶过滤层析实验结果图不理想：曲线的对称性非常不好，原因可能是操作过程中改变流速的问题。刚开始时流速非常慢，空白的管数很多。为了使实验速度稍微提高一点，在有颜色出现之后，我们就把流速调快，之后又反反复复调了好几次流速，导致每支试管中液体的量不一样，还有最深颜色两边颜色不对称，最终导致曲线两侧不对称。3.3醋酸薄膜电泳的实验结果也不是很理想，在点样的过程中，未吸取薄膜表面的水分，引起了了样品的扩散。还有薄膜被载玻片弄破了一点，导致电泳的起点参差不齐，-球蛋白电泳图谱中尤其明显，它的拖尾现象非常严重。全血清电泳出应有五条带，可是实验结果只有四条，可能是1、2靠的非常近辨认不出，若电泳时间再长一些，可能可以分出五条。查阅了相关的资料，分析带区过少的原因：除了上面两条原因之外，还有可能是缓冲液浓度高过高带区移动速度较慢，区带比较集中，肉眼难以分辨。还有就是在实验操作过程中始终未带手套，未防止指纹对电泳结果的影响。3.4纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用，纸层析的结果图结果还算理想，但也存在点样的问题，由于酶液的浓度较低，所以要多次点样，但是很难保证每次点样完全在同一个地方，所以跑出的结果图范围比较大。理论上谷氨酸、对照液和样品