实验五 底物浓度.doc

实验五 底物浓度、酶浓度对酶促反应速度的影响实验人：刘彦汶 学 号：20100331024 班 级：针外2010七同组人：严安、曲畅 实验日期：2012-4-25 指导老师：路雪雅一、 实验目的1、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验原理。2、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验方法。二、 实验原理碱性磷酸酶可以催化水解底物分子的磷酸基团。本实验用大鼠肾脏碱性磷酸酶催化水解磷酸苯二钠，水解反应如下：水解产物苯酚与酚试剂反应呈色，产物可以在660nm波长下比色，以检测苯酚浓度，从而确定反应速度。（一） 底物浓度对酶促反应速度的影响当酶量不变时，增加底物浓度，在初期，反应速度显著增加，当底物浓度增加至一定量时，反应速度增加缓慢，继续增加底物浓度时，反应速度不再增加，这说明所有酶发挥了最大效用，底物的量已过剩。将米氏方程两边取倒数所得到的双倒数方程式称林-贝氏方程：1/V=(Km/Vmax)1/S+1/Vmax 在林-贝氏方程中，1/V与1/S称线性关系。以1/V对1/S作图得到一条直线，其斜率是Km/Vmax，在纵轴上的截距为1/Vmax，在横轴上的截距为-1/Km。应用双倒数作图法可以求酶的Km值。（二） 酶浓度对酶促反应速度的影响当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影响反应速度，此时反应速度与酶浓度成正比，本实验可以帮助检查酶促反应条件的准确性和可行性。三、 实验器材试管、定量移液管、水浴锅、分光光度计四、 实验试剂PH为10的缓冲液、3、6、12mmol/L底物液、（1:4000）酶液、酚试剂、0.5mol/L碳酸钠五、 操作步骤及结果（一） 底物浓度对酶促反应速度的影响按下表操作试剂（ml）管号123456pH10.0缓冲液0.50.50.50.50.50.53mmol/L底物液0.16mmol/L底物液0.112mmol/L底物液0.10.30.5蒸馏水0.50.40.40.40.2酶液（1:4000）0.50.50.50.50.50.5底物浓度mmol/L0020.40.82.44.0混匀后，370C保温15分钟酚试剂0.50.50.50.50.50.50.5mol/L碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，370C保温15分钟混匀后，以1号试管为空白对照管，用660nm波长比色，测定各管吸光度底物浓度倒数L/mmol5.002501.250.420.25A00.3040.3860.4870.5490.6101/A03.292.592.051.821.64以吸光度倒数为纵坐标，底物浓度倒数L/mmol为横坐标作图，求米氏常数实验所作图如下（二） 酶浓度对酶促反应速度的影响按下表操作试剂（ml）管号12345pH10.0缓冲液0.50.50.50.50.512mmol/L底物液0.50.50.50.50.5蒸馏水0.5 0.40.30.20.1酶液（1:4000）0.10.20.30.4混匀后，370C保温10分钟酚试剂0.50.50.50.50.50.5mol/L碳酸钠3.03.03.03.03.0混匀后，370C保温15分钟混匀后，以1号试管为空白对照管，用660nm波长比色，测定各管吸光度酶浓度（1:4000）1501234A00.1390.1980.2370.305以吸光度为纵坐标，酶浓度（1:4000）15为横坐标作图，观察反应速度和酶浓度的关系【附注】1号试管是空白管不加酶液（在酶浓度试验中，应同时做相同的不同酶浓度的对照管，以校正酶液本身可能存在天然酚含量，但在本实验中，所用酶液中天然酚含量较小，可略去不计）实验所作图如下六、 结论及讨论结论1、 根据所作图，又由于吸光度A反映的是酶促反应的速率的快慢，即A与反应速度成正比，由此可推知1/V与1/S称线性关系。以1/A对1/S作图得到一条直线，其在横轴上的截距为-1/Km。应用双倒数作图法可以求酶的Km值。由图可求出Km=0.20 2、 当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影