脉冲场凝胶电泳实验流程.doc

脉冲场凝胶电泳实验流程一、 准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。1) 将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。2) 准备2% CleanCut琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 C水浴。3) 1000g、4 C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 C水浴。4) 将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。5) 使用50 mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate, 1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/mL Proteinase K）。将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有蛋白酶K反应液的50 mL离心管中。于50 C水浴中消化过夜，不需要振荡。注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。6) 用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mM PMSF使残余的蛋白酶K失活。7) 琼脂糖块可于4 C保存3个月至1年。8) 琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。4. 制备琼脂糖包埋的细菌DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3592）。1) 用50mL LB培养基或其他培养基培养细菌至OD600到达0.8 - 1.0。2) 当OD600到达0.8 - 1.0，加入氯霉素至终浓度180g/mL并继续培养1小时注：氯霉素可使不同细菌个体间染色体复制同步化并抑制染色体下一轮的复制。本步骤为可选步骤，但省略此步骤会导致靠近染色体复制终点的区域含量较低。过长时间的氯霉素处理会导致细胞形态变化，因此请迅速进入下一步操作。 3) 将上步得到的细菌培养液稀释20倍计数：取10L上步得到的细菌培养液，加入20L Gram Crystal Violet和170L PBS，用血球计数板在400倍镜下计数。 4) 准备2% CleanCut琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 C水浴。5) 每毫升琼脂糖块需要5 x 108个细菌。离心收集细菌，并用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 C水浴。注：有些细菌对EDTA浓度或悬浮缓冲液的渗透压敏感，并因此而提前裂解，这将导致DNA不适合脉冲场凝胶电泳。有些细菌如Enterococci需要悬浮缓冲液中含有1M NaCl才能防止因渗透压导致的裂解。又如Pseudomonas对EDTA浓度敏感，需要对悬浮缓冲液进行稀释才能避免过早裂解。尽管大多数的细菌不需要改变悬浮缓冲液，但还是要尽可能快地完成细菌包埋。6) 将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。7) 用50mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5mL lysozyme反应液(10 mM Tris, pH 7.2, 50 mM NaCl, 0.2% sodium deoxycholate, 0.5% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/mL lysozyme)。将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有lysozyme反应液的50 mL离心管中。于37 C水浴中消化30到60分钟，不需要振荡。注：有些细菌如Staphylococcus aureus对lysozyme不敏感，因此需用lysostaphin代替lysozyme。8) 倒掉lysozyme反应液并用25mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块。每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate, 1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/ml Proteinase K）。于50 C水浴中消化过夜，不需要振荡。注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。9) 用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mM PMSF使残余的蛋白酶K失活。10) 琼脂糖块可于4 C保存3个月至1年。11) 琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。5. 制备琼脂糖包埋的酵母DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Yeast Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3593）。1) 用50mL到100mL YPG培养基或其他培养基培养酵母至OD600超过1.0。2) 当OD600达到1.0，5000g、4 C离心10分钟收集酵母。并用10mL冰冷的50mM，pH8.0的EDTA溶液重悬酵母。3) 取10L酵母悬液加入990L水，用血球计数板于400倍镜下计数。4) 准备2% CleanCut琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 C水浴。5) 每毫升琼脂糖块需要6 x 108个真菌。离心收集真菌，并用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬真菌并置于50 C水浴。6) 在酵母悬液中加入Lyticase至1 mg/mL，并立即进行下一步。注：有些酵母在包埋后用Lyticase消化效果不佳，故推荐在包埋前将Lyticase加入酵母悬液。7) 将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。8) 用50mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5mL lyticase反应液(10 mM Tris, pH 7.2, 50 mM EDTA, 1 mg/ml lyticase)。将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有lyticase反应液的50 mL离心管中。于37 C水浴中消化30到60分钟，不需要振荡。9) 倒掉lyticase反应液并用25mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块。每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate, 1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/ml Proteinase K）。于50 C水浴中消化过夜，不需要振荡。注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。10) 用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mM PMSF使残余的蛋白酶K失活。11) 琼脂糖块可于4 C保存3个月至1年。12) 琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。6. 加快样品制备过程在某些情况下，上面的流程可以简化以加快样品制备速度。细菌和酵母的细胞壁酶可以在制胶块前加入细胞悬液，在胶块于室温凝固的15-20分钟里，细胞壁便可降解。对于脉冲场凝胶电泳，细胞壁并不需要完全降解，只要能够将DNA从细胞中释放出来就足够了。接下来的蛋白酶K消化时间也可以缩短至1-2小时。7. 用限制性内切酶消化胶块中的DNA1) 1个1.5mL离心管中可以消化1-3块胶块，如果有很多胶块需要消化，可以用24孔板。将胶块放入1mL限制性内切酶的1x反应缓冲液中于室温轻柔震荡1小时，弃去缓冲液。再加入0.3mL限制性内切酶1x反应缓冲液，每100L胶块加入50U限制性内切酶，在酶的反应温度下孵育2小时。2) 酶切后，用1mL洗涤缓冲液或电泳缓冲液洗涤胶块，于室温轻柔震荡约半小时。注：如果胶块需要储存超过1天，弃去洗涤缓冲液或电泳缓冲液并储存于4C，这样可以防止小于100kb的DNA扩散出胶块。3) 按前面流程制成的胶块尺寸适合于标准梳子（脉冲场电泳设备附带的梳子）制作的凝胶，如果选用其他规格的梳子，请将胶块切成合适的大小。根据待分离片段的范围，选择合适的标准品一起上样。二、 电泳1. 制胶略。2. 预冷电泳缓冲液向电泳槽中加入2.2L电泳缓冲液，先打开Power Module开关，再打开Pump开关，将流速调到最大值，再打开Cooling Module开关，将温度设置为14C。注：如果在13cm x 14cm（仪器附带）的制胶器中倒入100mL胶，加入2.2L缓冲液可刚好将胶没过，如果胶较厚则需要更多缓冲液才能将胶没过。将流速调至最大可加速缓冲液的冷却，请在温度达到设定值后或在电泳开始后将流速调到60。将温度设定在14C适用于大多数实验，也可根据需要设定为其他温度。3. 上样以下有3种上样方式可供选择：1) 将样品块放入梳孔中，并使样品块紧贴梳孔前壁。再向放有样品块的孔中加入1%低熔点琼脂糖（货号：161-3111），室温放置10-15分钟使低熔点琼脂糖凝固。2) 在倒胶前将样品块贴靠在梳齿上，倒胶，等胶凝固后拔出梳子，样品块和胶融为一体。3) 如果是液体样品，请使用和普通水平电泳相同的上样方法。接下来请根据仪器型号阅读相应的小节，编辑电泳程序并开始电泳。4. 使用CHEF-DRII系统电泳1) 输入参数CHEF-DRII系统能实现两个阶段（Block）的分离，每个阶段（Block）的参数包括起始转换时间（Initial Switch Time）、最终转换时间（Final Switch Time）、电泳时间（Run Time）和电场强度（Volts/cm）。每次电泳先运行Block1，然后运行Block2。i 打开Control Module开关，屏幕显示“b-1”，同时BLOCK指示灯亮起，指示当前输入Block1的参数；ii 输入电场强度：按VOLTS/CM键，VOLTS/CM指示灯亮起，再按RAISE键和LOWER键输入电场强度；iii 输入电泳时间：按RUN TIME键，RUN TIME指示灯亮起，再按RAISE键和LOWER键输入电泳时间；iv 输入起始转换时间：同时按BLOCK和VOLTS/CM键，BLOCK和VOLTS/CM指示灯同时亮起，再按RAISE键和LOWER键输入起始转换时间；v 输入最终转换时间：同时按VOLTS/CM和RUN TIME键，VOLTS/CM和RUN TIME指示灯同时亮起，再按RAISE键和LOWER键输入最终转换时间；vi 如果还要输入Block2，按BLOCK键，再按RAISE键，屏幕将显示“b-2” 同时BLOCK指示灯亮起，指示当前输入Block2的参数。按输入Block1的方法输入Block2。2) 允许的参数值范围i. 阶段（Block）允许值1-2。如果电泳时间设为0，该Block不运行。ii. 起始转换时间（Initial Switch Time）允许值0.1秒-65,000秒（显示65k）iii. 最终转换时间（Final Switch Time）允许值0.1秒-65,000秒（显示65k）iv. 电泳时间（Run Time）允许值0.1小时-999小时，如果设为0，该Block不运行v. 电场强度（Volts/cm）允许值0.6V/cm-6.0 V/cm3) 开始电泳参数输入完毕后，按START/PAUSE键开始电泳。开始电泳后按START/PAUSE键可暂停电泳，暂停后按START/PAUSE键可继续电泳。开始电泳后按住START/PAUSE键4秒可停止电泳，停止电泳后按START/PAUSE键，电泳将从头开始运行。5. 使用CHEF-DRIII系统电泳1) 输入参数CHEF-DRII系统能实现3个阶段（Block）的分离，每个阶段（Block）的参数包括起始转换时间（Initial Switch Time）、最终转换时间（Final Switch Time）、电泳时间（Run Time）、电场强度（Volts/cm）和脉冲夹角（Included Angle）。每次电泳先运行Block1，再运行Block2，再运行Block3。i 按BLOCK键，左侧屏幕显示“1”，指示Block1将被编辑。如果显示不是“1”，按左侧的RAISE或LOWER键直到屏幕显示“1”。ii 用左侧的RAISE和LOWER键输入起始转换时间（Initial Switch Time）、最终转换时间（Final Switch Time）和电泳时间（Run Time）。iii 用右侧的RAISE和LOWER键输入电场强度（Volts/cm）和脉冲夹角（Included Angle）。iv 如果还要输入Block2，按BLOCK键，再按RAISE键，屏幕将显示“2”，指示当前输入Block2的参数，按输入Block1的方法输入Block2。如果需要，请用相同的方法输入Block3。2) 允许的参数值范围i 阶段（Block）允许值1-3。如果电泳时间设为0，该Block不运行。ii 起始转换时间（Initial Switch Time）允许值0.1秒-65,000秒（显示65k）iii 最终转换时间（Final Switch Time）允许值0.1秒-65,000秒（显示65k）iv 电泳时间（Run Time）允许值0.1小时-999小时，如果设为0，该Block不运行v 电场强度（Volts/cm）允许值0.6V/cm-9.0 V/cmvi 脉冲夹角（Included Angle）允许值901203) 开始电泳参数输入完毕后，按START/PAUSE键开始电泳。开始电泳后按START/PAUSE键可暂停电泳，暂停后按START/PAUSE键可继续电泳。开始电泳后按住START/PAUSE键4秒可停止电泳，停止电泳后按START/PAUSE键，电泳将从头开始运行。4) 断电恢复如果在程序运行中断电，当前运行的程序将储存于内存。重新通电后，程序将在暂停状态停留2分钟后自动继续运行，在暂停的2分钟里，PAUSE/START RUN指示灯将闪烁。6. 使用CHEF Mapper XA系统电泳1) 输入参数CHEF Mapper XA系统有4种产生程序的方法，分别为1自动运算（AUTO ALGORITHM），适用于没有已知方法的电泳；2反转场（180FIGE），适用于长度小于100kb片段的分离或已知适用于反转场的电泳；3双矢量脉冲（TWO STATE），最常用的电泳方法，适用于大多数电泳；4多矢量脉冲（MULTI STATE），可编辑多阶段、多矢量脉冲的程序。以下将说明前3种产生程序的方法，请根据您的实验选择适当的方法，多矢量脉冲（MULTI STATE）的操作请参阅说明书，或咨询我公司技术支持。i. 自动运算（AUTO ALGORITHM）以下将以220 kb2,200 kb片断的分离为例说明该方法。a) 按AUTO ALGORITHM键。如果有已输入的程序，屏幕将显示“You will destroy last program - Go on?”，输入1确定。b) 屏幕显示“Molecular Weight: Low”，输入220，按K-BASES键，再按ENTER键。c) 屏幕显示“Molecular Weight: High”，输入2200，按K-BASES键，再按ENTER键。d) 屏幕第二行显示“Calibration Factor , enter for NC”，按ENTER键保留默认值。屏幕第二行显示“0.5x TBE,14 C, 1% PFC agarose”按ENTER键确认。e) 屏幕显示运算生成的电泳参数“6 V/cm, Run time= 28:59 (hr),Included angle 120”，连续按ENTER键将光标移至下页。f) 屏幕继续显示电泳参数“Int. Sw. Tm = 26.31s, Fin. Sw.Tm = 3m48.48s, Ramping factor: a = Linear”，连续按ENTER键至屏幕显示“A Program is in memory. Please enter another command.”。g) 按START RUN键开始电泳。ii. 反转场（180FIGE）a) 按180 FIGE键。如果有已输入的程序，屏幕将显示“You will destroy last program - Go on?”，输入1确定。b) 屏幕显示“Forward Voltage Gradient = V/cm”，请输入向前电泳的场强。先输入数字再按ENTER键。c) 屏幕显示“Int. Sw. Time =”，请输入向前电泳的起始转换时间。先输入数字，再按SECONDS或MINUTES或HOURS键，再按ENTER键。d) 屏幕显示“Fin. Sw. Time =”，请输入向前电泳的最终转换时间。先输入数字，再按SECONDS或MINUTES或HOURS键，再按ENTER键。e) 屏幕显示“Rev. Voltage Gradient = V/cm”，请输入向后电泳的场强。先输入数字再按ENTER键。f) 屏幕显示“Rev. Int. Sw. Time =”，请输入向后电泳的起始转换时间。先输入数字，再按SECONDS或MINUTES或HOURS键，再按ENTER键。g) 屏幕显示“Rev. Fin. Sw. Time =”，请输入向后电泳的最终转换时间。先输入数字，再按SECONDS或MINUTES或HOURS键，再按ENTER键。h) 屏幕显示“Total Run Time=”，请输入总电泳时间。先输入数字，再按MINUTES或HOURS键，再按ENTER键。i) 屏幕显示“A Program is in memory. Please enter another command.”，按START RUN键开始电泳。iii. 双矢量脉冲（TWO STATE）a) 按TWO STATE键。如果有已输入的程序，屏幕将显示“You will destroy last program - Go on?”，输入1确定。b) 在“Gradient V/cm”中输入电场强度，先输入数字，再按ENTER键；在“Run time= ”中输入总电泳时间，先输入数字，再按MINUTES或HOURS键，再按ENTER键；在“Included angle=”中输入脉冲夹角，先输入数字再按ENTER键。c) 在“Int. Sw. Tm =”中输入起始转换时间，先输入数字，再按SECONDS或MINUTES或HOURS键，再按ENTER键；在“Fin Sw Tm=”中输入最终转换时间，先输入数字，再按SECONDS或MINUTES或HOURS键，再按ENTER键。d) 接下来屏幕显示“Ramping factor a =”，直接按ENTER键保留默认值（线性的转换时间变化率）。e) 屏幕显示“A Program is in memory. Please enter another command.”，按START RUN键开始电泳。2) 允许的参数值范围i 自动运算（AUTO ALGORITHM）模式下的小片断长度（Molecular Weight: Low）允许值1kb-6mbii 自动运算（AUTO ALGORITHM）模式下的大片断长度（Molecular Weight: High）允许值1kb-6mbiii 起始转换时间（Initial Switch Time）允许值0.05秒-18小时iv 最终转换时间（Final Switch Time）允许值0.05秒-18小时v 电泳时间（Run Time）允许值1分钟-999小时vi 电场强度（Volts/cm）允许值0.6V/cm-9.0 V/cmvii 双矢量脉冲（TWO STATE）模式下的脉冲夹角（Included Angle）允许值01803) 开始电泳程序输入完毕后，屏幕显示“A Program is in memory. Please enter another command.”，此时按START RUN键可开始电泳。开始电泳后按PAUSE/CONT键可暂停电泳。暂停后按START RUN键可继续电泳。开始电泳后同时按START RUN和PAUSE/CONT键，屏幕显示“You will halt the program and clear it”，输入1可停止电泳。4) 断电恢复如果电泳过程中断电，若断电时间短于3小时，重新通电后电泳将继续运行。7. 染色及后续工作电泳结束后，将胶放入0.5g/mL EB溶液中（每100mL电泳缓冲液或水中加入5L 10mg/mL EB）染色20-30分钟，再放入电泳缓冲液或水中脱色30-60分钟。用凝胶成像仪照相。若长时间不使用脉冲场电泳系统，请排出电泳缓冲液并用水清洗电泳系统。注：长时间将电泳缓冲液放在电泳槽中并盖着盖子可能导致电泳槽盖变形。附录：常用配件及消耗品订货信息货号描述人民币报价(元)170-3713 50孔一次性样品模具616170-362210孔多次使用样品模具1745170-3711筛盖, 5个550170-432610孔梳子, 宽14 cm, 厚1.5 mm 277170-432510孔梳子, 宽14 cm, 厚0.75 mm277170-432415孔梳子, 宽14 cm, 厚1.5 mm277170-432315孔梳子, 宽14 cm, 厚0.75 mm277170-432220孔梳子, 宽14 cm, 厚1.5 mm277170-434430孔梳子, 宽14 cm, 厚1.5 mm277170-370414cm x 21cm制胶器4075170-362715孔梳子, 宽21 cm, 厚1.5 mm1047170-362830孔梳子, 宽2