不同物种Agouti基因编码区生物信息学分析.doc

不同物种Agouti基因编码区生物信息学分析摘要：为了研究不同物种Agouti基因的遗传多样性，该实验采用生物信息学方法比较分析了山羊、绵羊、牛、髯羊、野猪、马、犬、狒狒、黑猩猩、人、兔、家猫、鼠和猕猴Agouti 基因编码区(CDS)的遗传多样性。结果表明， 来自14个物种的77条基因序列中检测到93个多态位点，共生成30 种单倍型，物种间及物种内Agouti基因序列编码区存在较丰富的遗传多样性。关键词：物种；Agouti基因；遗传多样性Bioinformatics Analysis of Coding Regions of Agouti Gene among SpeciesTian Teng-fei Li Xiang-long Zhou Rong-yan Li Lan-hui(College of Animal science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding, 071001, China )Abstract: In this study, the CDS of the Agouti gene sequences of Capra hircus, Ovis aries, Bos taurus, Ammotragus lervia,Sus scrofa, Equus caballus, Canis lupus, Papio anubis, Pan troglodytes, Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus, Felis catus, Peromyscus and Macaca radiata were analyzed using the method of bioinformatics. And the genetic diversity was analyzed. The results showed that a total of 93 polymorphic sites were detected from 77 sequencesof 14 species, from which 30 hapolotypes were sorted, and there was rich genetic diversity of the CDS of the Agouti gene within and among species.Key words: species; Agouti gene; genetic diversity现代分子遗传学研究表明，Agouti基因通常编码对抗黑素细胞刺激素受体(melanoeyte stimulating hormone receptor，MSHR)的信号蛋白(agouti signaling protein，ASP)。Agouti信号蛋白由Agouti基因编码，人、鼠、狐狸、猪、绵羊等的Agouti基因相继被发现1,2，当Agouti基因表达时会引起棕黑素的产生，而Agouti不表达时则会引起真黑素的产生，从而调节真黑素和棕黑素之间的转换3，不同物种的Agouti基因及其信号蛋白有较高的同源性。随着对Agouti位点进一步研究，表明Agouti基因位点控制着毛囊内真黑素和棕黑素的相对数量，结构复杂，是一个含多等位基因的位点。林大光(1984)所述家兔的Agouti位点主要有2个等位基因A和a， A为刺鼠毛基因，其作用是使毛纤维上出现分段着色，整根毛纤维呈深色浅色深色的状态，a为非刺鼠毛基因，其作用是使毛纤维颜色一致，A对a完全显性4。近年来人们对Agouti基因位点的研究主要集中于鼠和人，Kwon（1994）等1发现人的Agouti基因位于染色体20q112区，编码的ASP由132个氨基酸构成，人与鼠的Agouti基因同源性高达85%， Agouti信号蛋白同源性高达89% (即89%的氨基酸序列完全一致)。目前已证实Agouti位点不是一个单一基因，具有许多等位基因5，其中两个等位基因对某一颜色起着重要的作用，因此研究Agouti基因的编码区对研究动物的毛色变异具有重要作用。本研究选用GenBank中已提交物种的Agouti基因的编码区序列，利用比较基因组学和生物信息学方法研究了该基因编码区的变异，以期探明该基因在不同种间及种内遗传分化，进而为动物毛色变异研究以及动物育种工作提供基础资料。1. 材料和方法1.1 序列来源 从NCBI网站/的GenBank中下载山羊、绵羊、牛、髯羊、野猪、马、犬、狒狒、黑猩猩、人、兔、家猫、鼠和猕猴等14个物种的77条Agouti基因序列（表1）。表1 不同物种的Agouti基因序列来源Table 1 The source of sequences for Agouti gene in different species物种(Species)序列数(Sample size)序列号(Access number)髯羊(Ammotragus lervia)1EU420031山羊（Capra hircus）3EF587236, EU037983, GU076166绵羊（Ovis aries）9EU057181, EU420022, EU420024, EU420025, EU420026, EU420027, EU420029, EU420030, NM_001134303牛（Bos taurus）5AH013175, NM_206843, X99691, X99692, XM_001790188野猪（Sus scrofa）11AJ427478, AJ634673, AY308996, AY308997, AY308998, AY916525, GQ373180, NM_001001648, NM_001011646, NM_001011647, NM_001011648马（Equus caballus）1NM_001164017犬（Canis lupus）1NM_001007263狒狒（Papio anubis）1NM_001164331黑猩猩（Pan troglodytes）4AB236870, AB236869, NM_001135627, AB236871人(Homo sapiens)4BC104238, BC104239, L37019, NM_001672兔（Oryctolagus cuniculus）1NM_001122939家猫（Felis catus）2AY237394, NM_001009190鼠（Peromyscus）10EU020066, EU020067, EU020068, GQ340867, GQ340875, GQ340877, GQ340896, L06451, NM_015770, NM_052979猕猴（Macaca radiata）23AB236875, AB236877, AB236881, AB236876, AB299213, AB299214, AB236873, AB236874, AB299207, AB299208, AB299209, AB299210, AB299211, AB299212, AB299215, AB299217, AB299218, AB299219, AB299220, AB236872, AB236878, AB236879, AB2368801.2 分析方法 先利用BioEdit 软件对77个不同序列的Agouti基因编码区进行比对分析，选取完整编码区序列(长度为435bp )进行比较后，利用 DanSP 4.20软件对其进行遗传多样性分析，生成单倍型，并计算遗传距离。再利用MEGA4.0软件的UPGMA方法进行聚类分析，构建聚类图。2. 结果与分析2.1 不同物种Agouti基因核苷酸多样性2.1.1 多态位点 在所分析的共有片段为435bp的77条序列中，发现93个多态位点，百分率为21.38%，其中单一多态位点16个，百分率为3.69%；简约多态位点77个，百分率为17.70%。不同物种内的多态位点数也各不相同，髯羊、山羊、绵羊、牛、野猪、马、犬、狒狒、黑猩猩、人、兔、猫、鼠和猕猴的多态位点数分别为2、9、6、8、38、48、53、54、59、63、41、94、99（表2），百分率分别为0.46%、2.07%、1.38%、1.84%、8.74%、11.03%、12.18%、12.41%、13.56%、14.48%、9.42%、21.61%、22.76%，其中鼠和猕猴的Agouti基因核苷酸变异较大，说明鼠和猕猴的Agouti基因多态性都比较丰富。表2 不同物种Agouti基因序列多态信息Table 2 Polymorphic information of Agouti gene in different species物种（Species）多态位点数（S）突变总数（Eta）单一多态位点（SP）简约多态位点（PIP）髯羊(Ammotragus lervia)2220山羊（Capra hircus）9990绵羊（Ovis aries）6651牛（Bos taurus）8880野猪（Sus scrofa）3838380马（Equus caballus）4848480犬（Canis lupus）4848480狒狒（Papio anubis）5353530黑猩猩（Pan troglodytes）5455540人(Homo sapiens)5959590兔（Oryctolagus cuniculus）6363630家猫（Felis catus）4141410鼠（Peromyscus）941043955猕猴（Macaca radiata）991126039S, 多态位点数; Eta, 突变总数; SP, 单一多态位点; PIP, 简约多态位点S, number of polymorphic sites; Eta, total number of mutations;SP, Singleton variable sites; PIP, parsimony informative sites2.1.2 单倍型及其多样性 根据序列比对，在77条Agouti基因序列中发现30种单倍型。各物种的单倍型多样性大小不一(表3)，该基因单倍型多样性表明种群间Agouti基因遗传变异丰富。平均核苷酸差异数（k）为22.5368，核苷酸多样性为0.1391。其中鼠的平均核苷酸差异数和核苷酸多样性最高，其次是山羊和猕猴，其他单倍型数都为1，表明鼠的Agouti基因存在较丰富的遗传多样性。表3 不同物种Agouti基因的单倍型多样性Table 3 Haplotype diversity of Agouti gene in different species物种Species序列N单倍型数Np单倍型多样性Hd平均核苷酸差异数目K核苷酸多样性山羊（Capra hircus）320.66676.00000.0370绵羊（Ovis aries）920.22220.88890.0055牛（Bos taurus）510.00000.00000.0000野猪（Sus scrofa）1120.18180.18180.0011黑猩猩（Pan troglodytes）410.00000.00000.0000人(Homo sapiens)410.00000.00000.0000家猫（Felis catus）210.00000.00000.0000鼠（Peromyscus）1070.933315.28890.0944猕猴（Macaca radiata）23130.93685.92890.0366N, 序列数; Np, 单倍型数; Hd 单倍型多样性; K, 平均核苷酸差异数目; , 核苷酸多样性N, Number of sequences; Np, No. of haplotype; Hd, Haplotype diversity;K, average number of nucleotide differences; , Nucleotide diversity2.1.3 物种间核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化 各种群间核苷酸歧异度(Dxy) 在0.01240.2447之间，净遗传距离在0.00690.1929之间，遗传分化在0.03371.0000之间(表4)，不同物种间核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化的变化范围都很大，其中人和黑猩猩以及绵羊和山羊间的核苷酸歧异度、净遗传距离均最小，说明人与黑猩猩的亲缘关系、绵羊和山羊的亲缘关系较近，其中鼠与其它物种间的核苷酸歧异度和净遗传距离均最大。这说明鼠与本研究中其他物种间亲缘关系较远，基本上与NCBI上的动物学分类相符合。 表4 不同物种核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化Table 4 Nucleotide divergence, net genetic distance and genetic differentiation of haplotype in different species物种Species山羊（Capra hircus）绵羊（Ovis aries）牛（Bos taurus）野猪（Sus scrofa）黑猩猩（Pan troglodytes）人(Homo sapiens)猫（Felis catus）鼠（Peromyscus）猕猴（Macaca radiata）山羊（Capra hircus）0.00690.01440.12350.14820.16050.11730.17890.1403绵羊（Ovis aries）0.0281（0.3950）0.01720.13310.15640.16740.12620.18700.1484牛（Bos taurus）0.0329（0.5572）0.0199（0.7412）0.11730.14200.15430.11110.17260.1347野猪（Sus scrofa）0.1425（0.4163）0.1364（0.6639）0.1179（0.7582）0.16050.17280.16050.18240.1524黑猩猩（Pan troglodytes）0.1667（0.5340）0.1591（0.7122）0.1420（1.0000）0.1611（0.7287）0.01240.14820.15470.0155人(Homo sapiens)0.1790（0.5340）0.1701（0.7122）0.1543（1.0000）0.1734（0.7287）0.0124（1.0000）0.15430.16700.0252家猫（Felis catus）0.1358（0.4470）0.1289（0.6026）0.1111（1.0000）0.1611（0.6168）0.1482（1.0000）0.1543（1.0000）0.19290.1419鼠（Peromyscus）0.2447（0.1014）0.2369（0.2610）0.2198（0.2802）0.2302（0.2903）0.2019（0.2552）0.2142（0.2552）0.2401（0.2046）0.1469猕猴（Macaca radiata）0.1771（0.0913）0.1694（0.1925）0.1530（0.1856）0.1712（0.2204）0.0338（0.1698）0.0435（0.1698）0.1602（0.1573）0.2124（0.0337）上三角为净遗传距离(Da)，下三角为核苷酸歧异度(Dxy)和遗传分化（Gst）（括号内）Above diagonal is net genetic distance(Da)；below diagonal is nucleotide divergence(Dxy) and genetic differentiation of haplotype（Gst）(in bracket)2.2 不同物种Agouti氨基酸多样性2.2.1密码子偏爱性 所截选的不同物种Agouti基因序列编码区中密码子有效值（ENC）为41.841 (0)6，经2检验，计算得到未校正的2值为0.792，说明Agouti基因对密码子有较强的偏爱性6。2.2.2 同义替换和非同义替换 不同物种77条 Agouti基因序列编码区中同义替换平均位点数为37.68个，非同义替换平均位点数为112.32个。 不同物种同义替换位点数(SS)为35.2839.17(表5），同义替换核苷酸多样性均值(s)为0.29147。非同义替换位点数（NSS）为110.83114.72，非同义替换核苷酸多样性均值(a)为0.08909。绵羊的非同义替换位点数较其它物种多，说明绵羊Agouti基因编码区的非同义替换较其它物种高。表5 不同物种Agouti基因同义替换和非同义替换Table 5 Synonymous and nonsynonymous substitution of Agouti gene in different species物种（Species）同义替换位点数(SS)非同义替换位点数(NSS)山羊（Capra hircus）35.94114.06绵羊（Ovis aries）35.28114.72牛（Bos taurus）36.50113.50野猪（Sus scrofa）36.41113.59黑猩猩（Pan troglodytes）39.17110.83人(Homo sapiens)38.50111.50家猫（Felis catus）37.50112.50鼠（Peromyscus）38.60111.40猕猴（Macaca radiata）39.09110.95SS, 同义替换位点数; NSS, 非同义替换位点数; SS, Synonymous sites; NSS, Nonsynonymous sites2.3 不同物种Agouti基因遗传分化分析 根据不同物种之间遗传分化（Gst），用MEGA4.0 软件的UPGMA方法构建不同物种分子聚类图（图1）。根据聚类图分析得出，人与猩猩的亲缘关系最近，绵羊、山羊、牛的亲缘关系较近，鼠与其他物种的亲缘关系最远，基本上与NCBI上的动物学分类相符合。 图1 根据物种间的遗传分化构建的聚类图Figure.1 Phylogenetic tree based on genetic differentiation of species3. 讨论3.1 不同物种的遗传分化和系统发育研究结果得到，不同物种间的核苷酸歧异度、净遗传距离和单倍型间的遗传距离均较大，这说明不同物种间遗传分化已经十分明显。从不同物种的77条Agouti基因序列构建的聚类图中可看到人先和黑猩猩聚在一起，然后再跟其他物种聚在一起，说明人与黑猩猩的亲缘关系最近；绵羊最先跟牛聚在一起，依次与山羊、家猫和野猪聚在一起，与动物学分类有些不符（绵羊与野猪的亲缘关系应该比家猫近），这可能与所选物种的Agouti基因序列较短、样本数量较少有关。3.2 同义和非同义替换及密码子偏爱性 同义替换不受自然选择的控制，而非同义的替代速率则远远低于同义替代，且其发生的速率与基因密切相关，这被认为是净化选择的结果7，在有些基因中，非同义替代速率远远高于同义替代，这是由于达尔的文正向选择造成7。本研究中发现，所选物种的Agouti基因的非同义替换位点数均明显高于同义替换位点数，说明所分析的这两个种群进化过程中可能受到正选择的影响8。在蛋白质编码过程中，不同物种或同一物种的不同基因在密码子使用上均存在明显的偏爱性，即密码子偏爱性现象9。本研究结果发现Agouti基因的某些密码子使用表现出较强的偏爱性。目前，对密码子使用的偏爱性尤其是在进化中的作用还没有合理的解释，有待今后进一步研究。3.3突变位点的分析在本研究中发现，物种间的Agouti基因有93个突变位点，这些突变位点是否与不同物种动物的毛发颜色的变化有关还需要进一步研究，在某些物种内发现仅生成一种单倍型，除了由于Agouti基因编码区在物种内较保守的原因外，可能还与这些物种样本含量太小有关。参考文献：1 Kwon H Y, Bultman S I, Loffler C, et al. Molecular structure and chrom-osomal mappin