cirilagin抗动脉粥样硬化.doc

受理编号 云南省教育厅科学研究基金项目申请书项 目 名 称： Corilagin对血管内皮细胞 和血管平滑肌细胞的保护作用研究项 目 类 别： 科学技术 所属学科及代码： 药理学 310.47 项 目 负 责 人： 郭 英 所 在 学 校： 昆明医学院 申 请 日 期： 二零零九年四月二十日 云南省教育厅 制填 报 说 明 一、请按云南省教育厅科学研究基金项目检查、评价实施办法及云南省教育厅科研经费管理办法的有关规定，如实填写各项内容。申请项目必须符合基金资助范围；各项内容要实事求是，逐条认真填写。二、申请书填写一律采用WORD软件、电脑打印，纸质材料要求A3纸双面印刷，中缝装订。三、部分栏目填写要求： 项目名称应确切反映研究内容，最多不超过25个汉字。 研究类别根据研究内容分为人文社科和科学技术。 项目性质根据研究类别而定，如研究类别为人文社科，其项目性质选基础研究、应用研究、实验与发展中一种，如研究类别为科学技术，其项目性质选基础研究、应用研究、实验与发展、R#D成果应用、其他科技服务中的一种。 所属学科及代码以学科代码表（国表）为准。 研究时间开始时间填“2009年6月”；完成时间不超过2012年6月。 一、项目基本情况项目负责人信息姓 名郭 英性 别女出生年月1980年4月民族汉学 历硕士学 位硕士专业技术职称讲师联系电话0871-531688313708840324E- 通讯地址昆明市人民西路191号昆明医学院药理研究室邮政编码650031项目基本信息研究类别科学技术项目性质基础研究所属学科药理学学科代码310.47起止年月2009年6月2012年6月申请资助0.7万元自筹经费合作单位信息单位名称联系人项目摘要（限200字）研究corilagin对OX-LDL所致内皮细胞损伤、VSMC增殖和迁移及tPA和PAI-1活性的影响；探索corilagin对tPA和PAI-1蛋白及mRNA表达的影响，阐明corilagin抗动脉粥样硬化作用的细胞分子机制。为将其研究成为自主创新和滇产植物来源的防治动脉粥样硬化新药提供科学依据。培养1名硕士研究生，提升青年教师的创新能力。发表2到3篇研究论文。二、项目组情况序号姓名出生年月性别职称/学位从事专业所在单位课题分工投入时间（月）签名1郭 英1980.4女讲 师/硕士药理学昆明医学院主 持82沈志强1965.10男教授博士药理学昆明医学院指导并参与6 4张小超1982.9女在读研究生药理学昆明医学院参加实验6总人数5高级中级初级博士生硕士生本科生注：1、项目组人员不得超过5人，其中包括项目负责人。2、签名不得使用打印或印刷体。三、研究依据及意义按以下主要提纲逐项填写：（1）研究的意义；（2）国内外研究现状、水平和发展趋势；（3）立论依据。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础。目前被普遍接受的Ross修正的“损伤反应”学说1认为，内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化形成早期的始动环节。血管内皮细胞损伤、血脂沉积、血小板粘附、血管平滑肌细胞增殖等多种因素的相互作用，最终形成动脉粥样硬化。越来越多的证据显示氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL)在内皮功能不全中扮演重要角色，是目前公认的致内皮细胞损伤的危险性因子之一2。OX-LDL可使内皮细胞皱缩，改变细胞形态和结构，破坏内皮细胞完整性，使血中单核细胞和LDL等成分易于进入内皮下层3；OX-LDL还抑制内皮的再生和内皮细胞的迁移，不利于血管修复。同时，OX-LDL促分裂原作用促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC) 增殖和移行。OX-LDL的这些作用在动脉粥样硬化中具有重要意义。临床研究发现冠心病患者血浆OX-LDL水平明显高于对照组，但两者之间的脂质水平无差异，提示OX-LDL水平独立于其它危险因素之外4。纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1) 作为纤溶酶原活化过程的重要调节者,不仅影响血栓形成，而且还参与平滑肌细胞增殖迁移和细胞外基质积聚等动脉粥样硬化的基本病理过程，在动脉粥样硬化的发生、发展中具有相当重要的地位。近年研究发现，人动脉粥样硬化血管中PAI-1表达增强，动脉粥样硬化的血管壁中PAI-1 mRNA 表达也明显上调，且PAI-1 mRNA水平与动脉粥样硬化病变程度一致【5】。粥样化斑块内PAI-1 的异常表达还与平滑肌细胞的迁移和增殖密切相关6。原位杂交研究显示7，在动脉粥样硬化血管增厚的内膜中可见到大量PAI-1 mRNA阳性细胞，并与病变严重程度相关，为PAI-1在动脉粥样硬化中的作用提供了直接证据。组织型纤溶酶原激活物（tissue type plasminogin activator，tPA）和PAI-1是内皮细胞功能的标记蛋白。tPA 减少、PAI-1增加是心脑血管病的一个独立危险因素。PAI-1的升高与急性心肌梗死、动脉粥样硬化和血管再狭窄等心血管疾病关系密切8。血管内皮细胞受到刺激或损伤时，可分泌和释放PAI-1，并与t-PA 结合而抑制血栓溶解。PAI-1也是导致粥样斑块不稳定和诱发血栓形成的重要原因。PAI-1可通过影响内皮细胞再生、新内膜形成、血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质沉积等方面促进动脉粥样硬化。临床研究发现，PAI-1及其mRNA在动脉粥样硬化病变血管中的表达均明显增高，并与纤维蛋白原相关9。纤溶系统受损后PAI-1的增高对预测冠脉事件的相对危险度最高10。由于PAI-1在动脉粥样硬化和血栓性疾病中的重要作用，PAI-1的表达调控受到了广泛关注，成为防治冠状动脉粥样硬化的新领域。近年来，动脉粥样硬化的发病率呈明显上升趋势且发病年龄越趋年轻化, 因而抗动脉粥样硬化药（antiatherosclerotic drugs）的研究日益受到重视。目前主要的抗动脉粥样硬化药物大多数为化学合成的调血脂药，作用方式停留在降低LDL和升高HDL水平上，还可引起较多的不良反应，故临床应用存在一定的局限性。因此，寻找植物来源、安全有效及作用于新靶点的抗动脉粥样硬化药物，是目前心脑血管领域最重要的研究课题之一。Corilagin (-1-o-galloyl-3，6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-d-glucose，1-酰-3，6-六羟基联苯二甲酰基葡萄糖，图1)，是从大戟科一年生草本植物叶下珠 (Phyllanthus urinaria) 提取的水溶性多酚类单体化合物11。叶下珠在我省的资源丰富，易在山坡荒地上生长，可人工栽培。作为一种传统的中草药主要用来治疗肝炎、肠炎、痢疾、肾炎水肿等病症。本课题组研究发现，从滇产叶下珠植物中获得的水溶性有效部位(PUW，含corilagin 60%) 对大鼠颈动脉血栓具有明显的溶解作用，延长兔白陶土部分凝血活酶时间（KPTT），促进血管内皮细胞产生tPA，抑制血小板与中性粒细胞之间的相互作用等多种心血管活性12,13。本课题组还发现，corilagin能降低内皮功能损伤的家兔血浆中血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）、丙二醛水平，对抗血小板活化因子（PAF）对血管内皮细胞的损伤作用，同时在体外能降低血浆中PAI-1的活性，提示其在动脉粥样硬化的防治中具有良好的前景。目前研究发现corilagin具有抗病毒和抗肿瘤活性14，其心血管活性仅见本课题组等少量报道15，而其对动脉粥样硬化的作用及机制研究则未见报道。我们的前期研究提示corilagin在动脉粥样硬化的防治中具有深入探索的价值。因此，本课题组在前期研究基础上，体外培养人脐静脉血管内皮细胞，观察corilagin抗OX-LDL致内皮细胞损伤作用；体外培养主动脉血管平滑肌细胞，探讨corilagin对OX-LDL引起的VSMC增殖和迁移的影响；检测血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中tPA和PAI-1活性的变化；采用免疫组化和RT- PCR方法检测corilagin对tPA和PAI-1蛋白及mRNA表达水平的影响。本课题将从细胞和分子水平进一步研究corilagin对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的保护作用及其可能的分子机制，为将其研究成为具有自主创新和云南特色植物来源的抗动脉粥样硬化药物提供科学的理论和实验依据。图1. Corilagin化学结构式四、研究内容按以下主要提纲逐项填写：（1）具体研究内容和重点解决的关键技术问题：1.体外培养人脐静脉血管内皮细胞，观察corilagin抗OX-LDL致内皮细胞损伤的保护作用；2.体外培养主动脉血管平滑肌细胞，观察corilagin对OX-LDL引起的 VSMC增殖和迁移的影响；3.测定血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中tPA和PAI-1活性的变化；4.免疫组化和RT- PCR方法检测corilagin对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞tPA和PAI-1蛋白及mRNA表达水平的影响。（2）创新点：1. 叶下珠植物在云南有丰富的资源（云南省景洪州的沙河乡、勐勐镇、临沧县均有GAP规范的种植基地），corilagin在该植物中含量高，本课题组的提取分离技术成熟简便，本项目实施有利于滇产药用植物叶下珠的进一步开发利用。2. 本课题组研究发现，从滇产叶下珠植物中获得的单体成分corilagin能降低内皮功能损伤的家兔血浆中vWF、丙二醛水平，对抗活性氧对血管内皮细胞的损伤作用，同时在体外能降低血浆中PAI-1的活性，我们的研究结果提示其在动脉粥样硬化的防治中具有良好的前景。目前国内外研究发现，corilagin具有良好的抗病毒和抗肿瘤活性，其心血管活性仅见本课题组等少量报道，而其对动脉粥样硬化的作用及机制研究则未见报道。3.血管内皮细胞的损伤和血管内皮细胞的增殖迁移是动脉粥样硬化发生发展的病理生理学关键基础，本项目以该两种细胞为研究对象，能较深入研究corilagin发挥抗动脉粥样硬化作用的关键靶细胞。4. 采用近年发现的与动脉粥样硬化形成关系密切的活性物质OX-LDL为诱导剂刺激血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，评价corilagin对目前认为是动脉粥样硬化独立风险因子tPA和PAI-1的调控，有利于阐述corilagin抗动脉粥样硬化作用的新型机制。5. 为将corilagin研究成为新型抗动脉粥样硬化药物提供进一步的药理学实验依据。（3）研究目标：预期目标：1. 研究corilagin对OX-LDL刺激血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的影响，探索其细胞、分子作用机制，为将其研究成为具有自主创新和滇产植物来源的抗动脉粥样硬化新型药物提供科学的药理学理论与实验依据。2. 通过项目实施，为深入研究源于滇产叶下珠药用植物的有效成分corilagin防治动脉粥样硬化提供药理学实验依据。 考核指标：1. 研究corilagin对OX-LDL刺激血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的影响，探索其细胞、分子作用机制。2. 发表研究论文2-3篇，其中至少1篇为核心期刊。3. 培养硕士研究生1名。4. 培养和提升药理学青年学术骨干的科研能力和创新意识。五、研究方案按以下主要提纲逐项填写：（1） 研究方法和技术路线：1. 按图2所示的总体研究方案进行CorilaginCorilagin细胞水平细胞水平分子水平分子水平内皮细胞tPA、PAI-1 OX-LDL损伤蛋白表达mRNA表达tPA、PAI-1活性细胞活性、增殖迁移血管内皮细胞血管平滑肌细胞图2. 滇产叶下珠中corilagin保护血管内皮细胞和血管平滑肌细胞作用研究总体方案2. Corilagin对人脐静脉内皮细胞的保护作用实验中分别设正常对照组、模型损伤组、阳性组(Vit E)和corilagin系列浓度组。2.1 MTT法检测氧化损伤内皮细胞的增殖：将生长融合的人脐静脉内皮细胞接种于96孔板，各组分别按相应浓度给予样品，正常组和损伤组给予不含样品的培养液为对照，24 h后，损伤组给予OX-LDL(终浓度100 mg/L)，作用4 h后，每孔加MTT 20 L，酶标仪492 nm测定吸光度(A)值。2.2 细胞内MDA含量和培养液中SOD含量的测定：将生长融合的内皮细胞接种于96孔板，各组分别按相应浓度给予样品，正常组和损伤组给予不含样品的培养液为对照，损伤组同时给予损伤组给予OX-LDL(终浓度100 mg/L)，作用4 h后，分别吸取细胞培养上清液，按试剂盒操作方法测定SOD含量，然后每孔加蒸馏水150 L，反复冻融细胞4次，取细胞悬液按试剂盒操作方法测定MDA含量。2.3培养液中tPA和PAI-1活性测定：按试剂盒说明书应用发色底物法于96孔酶标板上测定培养液中tPA和PAI-1的活性。2.4二苯胺法测定细胞凋亡：将内皮细胞接种于培养瓶里，待细胞贴壁生长融合后，分别给予样品24 h后，(正常组和模型组给予不含样品的培养液为对照)，加OX-LDL(终浓度100 mg/L)损伤4 h，分别用0.125%的胰蛋白酶消化，l000 r/min离心5 min，收集细胞(细胞计数约107个)，PBS洗涤3次，沉淀物用0.4 mL低张缓冲液(pH7.5，含10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，0.2% TritonX-100)裂解，于37 1.5 h溶破细胞。13000 g离心以分离断裂的DNA与完整的染色质。从上清得到的断裂DNA和沉淀得到的完整核酸各在体积分数为12.5%的三氯乙酸中4过夜。将各部分DNA用仪4 ml 体积分数为10%的高氯酸水解，90放置10 min，加入0.4 ml 4%的二苯胺溶液(用冰醋酸配制)、20 L 1.6 mg/ml乙醛水溶液。30过夜，595 nm测定吸光度(A)值，完整DNA百分数由两部分DNA的吸光度值之和计算。3. Corilagin对OX-LDL所致兔主动脉平滑肌细胞（0053SMC）增殖和迁移的影响3.1 MTT法测定对OX-LDL促进VSMC（0053SMC）增殖的影响：将生长融合的VSMC接种于96孔板，弃去原培养液，各组分别按相应浓度给予样品，正常组和模型组给予不含样品的培养液为对照，阳性组给予辛伐他汀，同时造模组给予OX-LDL(终浓度100 mg/L)，培养24 h后，每孔加MTT 20 L，酶标仪492 nm测定吸光度(A)值。3.2 对VSMC迁移的影响：参照Sarkar等建立的方法，预先于6孔板每孔底部放置1盖玻片，然后将VSMC接种于6孔板，待细胞在盖玻片上贴壁并生长融合后，在无菌条件下将盖玻片取出，用无菌刀片将玻片上的VSMC沿一直线刮除一侧，放回6孔板中，并分别按相应浓度给予样品，空白组给予不含样品的培养基为对照，辛伐他汀为阳性对照药，作用24 h后，取出盖玻片，进行结晶紫染色。在显微镜下观察玻片上细胞迁移距离，测定迁移距离最远的细胞至细胞边缘的距离，每张玻片取3-4处进行测定，取平均值作为细胞迁移距离。4Corilagin对tPA和PAI-1蛋白及mRNA表达水平的影响4.1 免疫组织化学方法检测tPA和PAI-1蛋白表达：在24孔培养板内预置一盖玻片按以上方法进行细胞接种和分组加药处理, 48 h后取出长有细胞的盖玻片, 0. 1 moL/L PBS冲洗，4 %多聚甲醛固定后的内皮细胞，0.3 %H2O2 阻断内源性过氧化物酶20 min，正常山羊血清封闭20 min ,加兔抗人tPA、PAI - 1 多克隆抗体(稀释度1 200) ，对照组加PBS (0.01 mol/ L，pH 7.2)，4 保湿过夜，PBS 洗脱，分别加生物素标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记卵白素，DAB 显色。在免疫细胞化学染色过程中，以PBS 代替一抗做阴性对照。染色结束后在光学显微镜下观测目的蛋白表达和分布情况。棕黄色颗粒或弧线为目的蛋白表达阳性着色，蓝色为苏木素复染细胞核着色。量图像分析系统分析内膜阳性染色面积比(阳性染色面积/测量窗面积)及平均光密度值(测得光密度/测量窗面积)。4.2 RT- PCR检测tPA和PAI-1 mRNA表达：采用异硫氰酸胍氯仿一步法，提取上述细胞总RNA。以琼脂糖凝胶电泳可见较明亮的RNA条带判定总RNA质量符合实验要求。逆转录：各取剩余RNA 15 L加入oligodT 1 L，5000 g 4离心3 min，放65水浴10 min，再放冰上骤冷，加入DEPC处理水20 L，Rnasin l L，10 mmol/L DNTPs 2 L，逆转录酶1 L，置恒温水溶槽中，42孵育2 h，取出后置冰上骤冷，贮存-86备用。取反转录后产物cDNA作为模板进行PCR扩增。扩增以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参照, RT-PCR反应体系为20L, 含SYBR Premix Ex Taq (2 ) 10L, PCR Forward Primer ( 10 mol/L) 0.4 L，PCR Reverse Primer ( 10 mol/L) 0.4 L，ROX Reference Dye (50 )，0.4 L，cDNA模板1 L，ddH2O 7.8 L。95 预变性10 s，然后40次循环，每次循环条件为95 变性5 s，60 退火、延伸31 s。每个样本重复3次。利用RT-PCR数据分析软件( SDS，Version 1.3，TaqMan)记录CT值。PCR扩增引物序列：tPA 上游引物：5-AACCATCACGAG2CAACAT-3下游引物：5-AGGCGTATCTTCTGTGGA-3，（扩增长度为305 kb）PAI-1 上游引物：5- GCTGGTGAATGCCCTCTACT-3下游引物：5- GCAGTTCCAGGATGTCGTAGT-3 (扩增产物210 bp)5 统计学处理实验所得数据用均数标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用q检验，以a=0.05作为显著性检验标准。（2） 方案的可行性论证：本课题是我们在云南省天然药物药理重点实验室近年大量前期工作基础上的进一步深入。项目组主要成员作为子课题负责人完成了国家自然科学基金地区重点项目：滇产萜类、酚类和甾体皂甙类的抗肿瘤和心血管生物活性研究（已结题验收），承担云南省自然科学基金重点项目一种新作用机制抗血栓药 叶下珠有效部位的临床前研究（已结题验收），并取得2项专利（1. 沈志强,董泽军，陈植和,谭建文。叶下珠及同属植物醇提物在制药中的应用。授权号:ZL00112893.0；2. 沈志强，彭华，董泽军。1-酰-3，6-六羟基联苯二甲酰基葡萄糖化合物Corilagin在制备抗血栓药物中的应用。授权号：ZL00112894.9）。本课题组成员已掌握血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的培养和损伤模型建立、免疫组化、western blot及PCR等相关技术。该项目具备良好的前期工作基础，项目组具备较好的科研素质和技术力量。云南省天然药物药理重点实验室 拥有完成本项目研究所需的研究室 (心血管药理研究室、分子药理研究室、细胞室和病理研究室) 及相关设备，具备完成本项目的条件。按照所设计的研究方案和采用的技术方法，能完成本项目的研究内容，达到预期目标。 （3）总体研究进度计划：2009年6月2010年5月：体外培养脐静脉血管内皮细胞，观察corilagin抗内皮细胞氧化损伤作用；体外培养脐动脉血管平滑肌细胞，观察corilagin对VSMC增殖和迁移的影响。整理分析实验数据、发表论文2010年 6月2011年5月：观察血管内皮细胞和平滑肌细胞中tPA和PAI-1活性的变化。 整理分析实验数据、发表相关研究论文。2011年 6月2012年6月：研究corilagin对tPA和PAI-1蛋白及其mRNA表达水平的影响。整理分析实验数据，发表论文，撰写结题验收材料。（4）预计将遇到的难题： 暂无。六、预期研究成果及应用前景按以下主要提纲逐项填写：（1）预期研究成果及提供形式；形成23篇学术论文。为深入研究源于滇产药用植物叶下珠的有效成分corilagin在防治动脉粥样硬化方面提供药理学实验依据。培养药理学高层次人才，提升青年教师的创新能力，促进药理学科的建设与发展。该项目研究成果以论文形式提交。发表研究论文2-3篇，其中至少1篇为核心期刊。（2）应用前景。有较好的应用前景。注：此页可自行加页，但不得影响申请书中其他页面的版式。七、研究工作基础和条件按以下主要提纲逐项填写：（1）项目组人员科研概况：郭英（申请者，主持该项目工作），女，29岁，讲师、硕士。2002年7月本科毕业于四川大学华西药学院药学专业；2005年7月毕业于四川大学华西药学院，获药理学硕士学位后在昆明医学院基础药理教研室工作，从事心脑血管药物药理学的研究与新药开发工作，研究方向为心脑血管药理学。研究生期间参与完成了课题“慈竹提取物对大鼠心肌缺血的影响”及“淫羊藿提取物对大鼠心肌缺血的影响”的研究工作，此两项课题均为国家自然科学基金项目的子课题。另外，还参与了盐酸戊乙奎醚的药理作用的研究工作。近年共发表研究论文 5 篇，其中3篇为核心期刊。 近期主要论文：1. 滕佳，郭英，崔琳，纪芳，张小超，沈志强。Corilagin对PAF诱导血管内皮细胞损伤的保护作用。昆明医学院学报，2009，30（6）：已录用2. 郭 英，谢建平，曾博程，等. 淫羊藿提取物对大鼠急性心肌缺血的影响J.华西药学杂志，2005, 20(1):44-453. 郭 英，谢建平，莫正纪. 淫羊藿提取物对急性心肌缺血大鼠血流动力学的影响J.中国医药工业杂志，2005, 36(5):286-2874. 郭 英，谢建平，莫正纪. 盐酸戊乙奎醚药理研究及临床应用的新进展J.华西医学，2004, 19(4):702-7035. 谢建平，莫正纪，郭 英，等. 盐酸戊乙奎醚滴鼻剂对豚鼠鼻炎模型的治疗作用J.中国新药杂志，2004, 13(4):322-3236. 郭 英，谢建平，王 蕾，等. 关于进一步加强研究生培养的几点思考意见.中国高等医学教育研究进展，2007, 222-224沈志强 （指导并参加本项目），男，1965年10月生，博士，教授，博士研究生导师，研究方向：心血管药理学。1995年至今一直于昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室从事药物药理学的研究工作。中国药理学会理事会理事、中国心血管药理专业委员会委员、云南省药理学会理事、云南省植物学会理事和植物化学与天然药物专业委员会委员，中国药理学报和天然产物研究与开发特约审稿专家、昆明医学院学报常务编委。云南省学术与技术带头人后备人才、昆明医学院药理学重点建设学科心血管药理学带头人。主持了1项国家自然科学基金项目，完成了1项国家自然科学基金地区重点项目 滇产萜类、酚类和甾体皂甙类的抗肿瘤和心血管生物活性研究（项目号：39969005，2000.012003.12，已结题验收）；承担并完成了3项云南省自然科学基金资助项目(1.一种新作用机制抗血栓药 叶下珠有效部位的临床前研究；2. 阿司匹林铜对血管内皮细胞、血小板和中性粒细胞之间相互作用的影响及其分子机制研究3. 云南省科技厅社会发展计划重点项目：源于滇产药用植物叶下珠的老鹳草素抗骨质疏松症作用及其机制研究（项目号：2008CC009，主持，45万元）。获云南省自然科学二等奖2项、三等奖1项，获国家授权发明专利4项。在国内外学术刊物发表研究论文60余篇，其中18篇为SCI收录，国内核心期刊论文近40篇。 主要科研项目：1. 国家自然科学基金项目：老鹳草素抗实验性骨质疏松症作用及其细胞分子生物学机制研究（主持. 项目号：30660212，2007.012009.12）2. 国家自然科学基金地区重点项目：滇产萜类、酚类和甾体皂甙类的抗肿瘤和心血管生物活性研究（子课题负责人. 项目号：39969005，2000.012003.12，已验收结题）3. 云南省科技厅社会发展计划重点项目：源于滇产药用植物叶下珠的老鹳草素抗骨质疏松症作用及其机制研究（项目号：2008CC009，主持，45万元，）4. 云南省应用基础基金重点项目：一种新作用机制抗血栓药 叶下珠有效部位的临床前研究（1999.102002.10，已验收结题）5. 国家自然科学基金项目：抗脑缺血活性香叶基香豆素的研究（项目号：30200350，2003.012005.12，已验收结题）6. 云南省自然科学基金项目：阿司匹林铜对血管内皮细胞、血小板和中性粒细胞之间相互作用的影响及其分子机制研究（主持. 1998.7-2001.7，已结题验收）科研奖励：1. 卿晨，李玛琳，刘锡葵，沈志强. 2008年12月获云南省自然科学二等奖. 滇产生物中萜类、酚类和甾体皂甙的抗肿瘤和心血管活性研究. 2. 刘伟平，沈志强，普绍平，李玲，谌喜珠，陈植和，陆瑛. 2002年8月获云南省自然科学二等奖. 阿司匹林铜的合成鉴定及其抗血小板抗血栓作用研究. 3. 沈志强，吴蓝鸥，刘伟平，杨为民，陈植和，谌喜珠，普绍平，何健. 2003年8月获云南省自然科学三等奖. 阿司匹林铜对血管内皮细胞、血小板和中性粒细胞之间相互作用的影响及其分子机制的探讨. 专利：(1) 刘吉开，沈志强，董泽军，陈植和，谭建文。叶下珠及同属植物醇提物在制药中的应用。授权号:ZL00112893.0 (2) 刘吉开，沈志强，彭华，董泽军。1-酰-3，6-六羟基联苯二甲酰基葡萄糖化合物（Corilagin）在制备抗血栓药物中的应用。授权号：ZL00112894.9(3) 郝小江，聂晶磊，沈月毛，陈昌详，沈志强，李玲。绣线菊二萜生物碱，其制备方法和用途。授权号：ZL97112872.3 (4) 刘吉开，沈志强，董泽军，丁智慧。一种预防或治疗骨质疏松症的药物及其制备方法和应用。授权号:ZL 02113653.X （授权日2008年8月27日） 近年主要相关论文：1. Shen Zhiqiang, Dong Zejun, Peng Hua, Liu Jikai. Modulation of PAI-1 and tPA activity and thrombolytic effects of corilagin. Planta Medica, 2003，69 (12): 1109-1112（SCI收录）2. 沈志强，董泽军，雷伟亚，陈植和，刘吉开。叶下珠有效部位对血栓形成的影响及其作用机制初探。天然产物研究与开发，2003，15 (1)：46-503. 沈志强，董泽军，刘吉开。叶下珠有效部位的溶栓作用及其对PAI-1和tPA活性的影响。天然产物研究与开发，2003，15 (5)：441-4454. 沈志强，陈蓬，段理，董泽军，刘吉开。叶下珠有效部位对凝血系统的影响。中草药，2004，35（5）：539-5425. 沈志强，陈 蓬，段理，董泽军，陈植和，刘吉开。 叶下珠有效部位静脉注射对动物血栓形成及凝血系统的影响。中西医结合学报，2004，2（2）：106-1106. Duan WG, Shen ZQ, Yan M, Yun Y，Zhang LY. Corilagin, a promising natural product to treat cardiovascular diseases. Phytopharmacology & Therapeutic, Values II, 2007，20（5）：163-172（SCI收录）7. 何波，杨莉，纪芳，张小超，沈志强（通讯作者）。Corilagin对LPS，H2O2诱导血管内皮细胞损伤的保护作用。中国药学杂志，2009：待发表8. 武鸿翔，董跃伟，沈志强（通讯作者）。 柯里拉京 (corilagin) 对血栓形成的影响及其机制探讨。中国新药杂志，2009，18:已录用9. 杨丽川，胡建林，张荣平，沈志强（通讯作者）。血竭、包合血竭与复方活化血竭抗血小板聚集实验研究。中药药理与临床，2008，24（3）：74-7710. Yun Yu, Chen Peng, Zheng Chunlan, Yang Yong, Duan Weigang, He Bo, Ma Jiaqing, Wang Dianhua, Shen Zhiqiang (通讯作者). Copper-aspirin complex inhibits cyclooxygenase-2 more selectively than aspirin. YAKUGAKU ZASSHI, 2007, 127(11):1869-1875（SCI收录）11. 陈鹏，云宇，张小超，王殿华，雷伟亚，沈志强（通讯作者）。灯盏乙素对DPPH所致血管内皮依赖性舒张功能障碍的影响。昆明医学院学报，2007，28(6):6-912. 詹合琴，李平法，杨锦南，莫景花，沈志强（通讯作者）。三七皂苷Rgl对t-PA和PAI-1水平的影响。中国药理学通报，2006，22（7）：869872.13. 陈鹏，胡晓立，雷伟亚，沈志强（通讯作者）。虎杖苷对血栓形成及细胞间相互作用的影响。云南大学学报（自然科学版），2006,28(4)：364-367.14. 陈鹏，胡晓立，雷伟亚，沈志强（通讯作者）。三七叶甙对兔血小板聚集功能的影响。云南大学学报（自然科学版），2005，27（1）：82-8515. 陈鹏，杨丽川，雷伟亚，沈志强（通讯作者）。白黎芦醇甙对血小板聚集功能及内钙水平的影响。天然产物研究与开发，2005，17(1)：21-2416. Shen Zhiqiang, Chen Peng, Liu Weiping. Effects of copper-aspirin complex on platelet-neutrophil interactions. Acta Pharmacological Sinica，2004, 25 (5): 576-580（SCI收录）17. Shen Zhiqiang, Zhang Liuyi, Chen Peng, Chen Zhihe, Hao Xiaojiang. Spiramine N-6, a novel agent of antiplatelet and anti-platelet-neutrophil interactions. Nat Prod R & D, 2004, 16(2):136-13918. Zhiqiang Shen, Zejun Dong, Peng Chen, Ling Li, Zhihe Chen, Jikai Liu. Effects of plumbagin on platelet aggregation and platelet-neutrophil interactions. Planta Medica，2003, 69 (7):605-609（SCI收录）19. Shen Zhiqiang, Li Ling, Chen Zhihe, Liu Weiping. Inhibitory effects of dimeric copper(ii) bis(o-acetoxybenzoate) on platelet-neutrophil adhesion and thrombosis. Metal Based Drugs，2002, 8 (2):103-10520. 沈志强，吴兰鸥，陈植和。人参皂甙-Rg1 对血小板-白细胞间的粘附及激活的白细胞引起血小板聚集功能的影响. 中草药, 2002, 33 (2): 138-14021. 沈志强，吴蓝鸥，段 理，陈植和，雷伟亚，刘吉开。中性粒细胞对洗涤血小板聚集功能的影响。中国病理生理杂志，2002，18 (7)：156-15822. Shen Zhiqiang, Li Ling, Wu Lanou, Chen Zhihe. Effects of copper-aspirin complex on plasma prostaglandin F1a level and platelet cytosolic calcium in rabbits. Platelets，2000,10 (5):345-348（SCI收录）23. Shen Zhiqiang, Chen Zhihe, Li Ling, Nie Jinlei, Hao Xiaojiang. Effects of the Diterpene spiramine Q from Spiraea japonica var. incisa. Planta Medica，2000, 66 (3): 287-289（SCI收录）24. Shen Zhiqiang, Chen Zhihe, Duan Li. Effect of protopine on cytosolic Ca2+ in rabbit platelets. Acta Pharmacological Sinica，1999, 20 (4): 338-340（SCI收录）25. Shen Zhiqiang, Liu Jikai, Dong Zejun, Chen Zhihe. A novel plant-original PAI-1 inhibitor (LSW) and its antithrombosis. Acta Pharmaceutical Sinica，2000，35：82（2）项目前期研究基础及阶段性成果（附证明材料）：本项目组前期研究发现，Corilagin (-1-O-galloyl-3，6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-d-glucose，1-酰-3，6-六羟基联苯二甲酰基葡萄糖)，是从大戟科一年生草本植物叶下珠 (Phyllanthus urinaria) 提取分离的多酚类单体化合物。我们前期研究发现corilagin对电刺激大鼠颈动脉血栓具有明显的溶解作用，抑制血小板 a 颗粒释放1型纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor type-1, PAI-1)，同时促进组织型纤溶酶原激活物（tPA tissue-type plasminogen activator, tPA）的产生，对PAF引起的血管内皮细胞损伤有保护作用，提示corilagin具有抗动脉粥样硬化作用。本项目深入研究corilagin对OX-LDL所致内皮细胞损伤、VSMC增殖和迁移及tPA和PAI-1活性的影响；探索corilagin对tPA和PAI-1蛋白及mRNA表达的影响，阐明corilagin抗动脉粥样硬化作用的细胞分子机制。为将corilagin研发成为新型抗动脉粥样硬化药物提供实验依据，具有重要的理论意义和实用价值。本项目组相关前期研究工作文献资料相关专利：1. 叶下珠及同属植物醇提物在制药中的应用。授权号:ZL00112893.0 2. 1-酰-3，6-六羟基联苯二甲酰基葡萄糖化合物（Corilagin）在制备抗血栓药物中的应用。授权号：ZL00112894.相关研究论文：1Shen Zhiqiang, Dong Zejun, Peng Hua, Liu Jikai. Modulation of PAI-1 and tPA activity and thrombolytic effects of corilagin. Planta Medica, 2003，69 (12): 1109-1112（SCI收录）2沈志强，董泽军，雷伟亚，陈植和，刘吉开。叶下珠有效部位对血栓形成的影响及其作用机制初探。天然产物研究与开发，2003，15 (1)：46-503沈志强，董泽军，刘吉开。叶下珠有效部位的溶栓作用及其对PAI-1和tPA活性的影响。天然产物研究与开发，2003，15 (5)：441-4454沈志强，陈蓬，段理，董泽军，刘吉开。叶下珠有效部位对凝血系统的影响。中草药，2004，35（5）：539-5425沈志强，陈 蓬，段理，董泽军，陈植和，刘吉开。 叶下珠有效部位静脉注射对动物血栓形成及凝血系统的影响。中西医结合学报，2004，2（2）：106-1106. 滕佳，郭英，崔琳，纪芳，张小超，沈志强。Corilagin对PAF诱导血管内皮细胞损伤的保护作用。昆明医学院学报，2009，30（6）：已录用（3）实验室仪器设备条件（人文社科类不需填写）：昆明医学院科研仪器中心和云南省天然药物药理重点实验室是已建立了心血管药理研究室、分子药理研究室、细胞研究室和病理室。拥有台式低温冷冻离心机、CO2培养箱、超净工作台、超声细胞破碎仪、倒置相差显微镜、奥林巴斯多人共览显微镜、荧光显微镜、低温冰箱等必备仪器。为本项目的顺利实施提供了很好的硬件支撑。注：此页可自行加页，但不得影响申请书中其他页面的版式。八、研究主要参考文献按文献目录的相关标准逐项填写，限15篇。参考文献1. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993, 362(6423):801-8092.Lusis AJ. Atherosclerosis. Nature, 2000, 407(2): 233-2413.Steinberg D. LDL oxidation and its pathobiological significance. J Biol chem, 1997, 272(2)：20963 - 209664.Toshima S, Hasegawa A, Kurabayashi M, et al. Circulating oxidized low density lipoprotein levels. A biochemical risk marker for coronary heart disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20(10):2243-22475.Rossignol P, Luttun A, Martin-Ventura JL, et al. Plasminogen activation: a mediator of vascular smooth muscle cell apoptosis in atherosclerotic plaques. J Thromb Haemost, 2006, 4(3):664-706.Hilfiker PR, Wangh JM, Li Hawhins JJ, et al. Enhancement of neointima formation with tissue type plasminogen activator. J Vasc Surg, 2001, 33(4) :8217.Salame MY, Samani NJ, Masood I, et al. Expression of t he plasminogen activator system in the human vascular wall. A