兰花组织培养技术.doc

甘肃农业大学生命科学学院自考本科毕业论文（设计）高 等 教 育 自 学 考 试毕 业 论 文论文题目： 兰花组织培养技术 作者姓名： 党 莎 专 业： 应用生物技术 主考学校： 甘肃农业大学 准考证号： 440509115003 指导教师姓名职称： 甘肃省高等教育自学考试办公室印制2010年09月20日应用生物技 术本科论文论文标题： 兰花组织培养技术 论文标题： Orchid tissue culture 论文作者： 党 莎 论文作者： DANG Sha 目 录摘要1关键词1英文摘要11.无菌培养的建立11.1组织培养的发展史及兰花的形态特征11.2培养容器的洗涤及培养基的制作21.3外植体的采集及接种32.继代增殖32.1试管苗生根壮苗培养42.2试管苗的驯化移植43.影响兰花原球茎增殖的因素43.1基本培养基成分对茎增殖的影响43.2激素的影响53.3切割方式对其影响53.4活性炭53.5含糖量及培养基硬度的作用53.6继代周期的影响54.影响兰花生根和移栽成活的因素54.4活性炭有否对兰花生根的影响54.2生长调节物质的不同种类及浓度比例的影响64.3试管苗的生理状况64.4无机盐浓度65.兰花组培的应用65.1快速繁殖优良品种65.2建立无病毒株系65.3种质资源的保存与交换66.兰花病虫害防治66.1兰花主要害虫及有害动物66.2兰花主要病害67.结论7参考文献8致 谢9兰花组织培养技术党 莎（甘肃农业大学生命科学技术学院 应用生物技术 730070）摘要：兰花属兰科（Orchidacere）多年生草本植物，中国兰花为兰科属中的地生兰。其香味怡人，花色淡雅，品种丰富，素有“花中君子”之称。具有很强的观赏价值和经济价值，深受人们的喜爱。如春兰、建兰、墨兰、寒兰等都是珍贵的观赏兰。此外，其也是目前世界上栽培较广的切花材料之一，兰花的切花生产，需要大批量的种苗，要获得优质高产，兰花种苗必须具备种性一致，生长齐一，长势旺盛的特点。在种苗生产上运用最广泛的是组培快繁和分株。生产实践证明，运用组织培养快繁技术生产种苗，其长势旺盛，品种复壮，抗病性强，切花质量好，对加快优良品种的培育，挽救珍惜濒危种类等起到十分重要的作用。关键词：组织培养；兰花；养护管理Orchid tissue cultureDANG Sha（Applied Bio-technology, College of Life Sci. &Tech., Gansu Agricultural University, 730070）Abstract: The orchid is Orchidaceae (Orchidacere) perennial herbs, Chinese orchid is an orchid in terrestrial orchids. The scent is pleasant, elegant colors, variety, known as Gentleman flowers, said. Highly ornamental value and economic value, very popular. Such as Chunlan, Cymbidium, Cymbidium, Cymbidium orchids and other ornamental and precious. In addition, it also is the worlds cultivated a broader one cut material, orchid cut flower production, require large quantities of seed, to obtain high-yield, species of orchid seedlings must have consistent growth and homogeneity, the characteristics of growing strong . In the seed production is the most widely used tissue culture and ramet. Practice shows, the use of tissue culture micropropagation technology to produce seedlings, the growing vigorously and rejuvenation varieties, disease resistance, flower quality, and speed up the cultivation of improved varieties, save endangered species such as value plays an important role.Key words: tissue culture; orchids; conservation and management1.无菌培养的建立1.1组织培养的发展史及兰花的形态特征1.1.1组织培养1898年德国植物学家HaberLandt用实验方法检验了细胞学说，1902年其由提出培养植物的体细胞可成为人工培养。1906年Brow在人工合成培养基上进行无菌外植体的培养，发现各种胚在培养基上有增殖生长的反应。1922年 HaberLandt的学生和美国科学家Robbins分别报道了根尖离体培养并取得成功。1931年我国学者李继侗在银杏胚胎的离体培养中，首次发现和利用了植物的天然提取物。1934年美国学者White通过对番茄离体根的培养，建立了第一个可以正常生长的无性繁殖系。至1958年Steward和Shantz用胡萝卜根外植体愈伤组织进行液体培养，继之证明了植物细胞的全能性。1960年Cocking用酶法分离原生质体成功。1973年在英国成立了国际植物组织培养协会“IAPIC”。1.1.2兰花兰花在植物分类学上属于单子叶植物中的一个科，为多年生草本植物，附生、地生或腐生。兰花根呈圆柱状，属肉质组织，茎很短，高度约为2-3cm，兰叶大多叶边全缘，有的略有锯齿。其花属于不整齐花范畴，总状花序。兰属植物的果实为蒴果，呈三角或六角形，俗称“兰荪“。1.2培养容器的洗涤及培养基的制作1.2.1培养容器的洗涤容器的洗涤是否干净直接影响组织培养的成败，为保证培养材料在瓶内生长健壮，在培养前期一定要对容器进行彻底的洗涤与灭菌。以达到“瓶壁锃亮、水膜均匀，不挂水珠”为标准。1.2.2培养基的制作培养基是植物组织培养的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到外植体的生长于分化。组培快繁中最常用的培养基主要有MS、ML、WH、SH等。但现最常用的母液为MS。母液要根据药剂的化学性质分别配置，一般配成大量元素、微量元素、铁盐，维生素类的母液。其配置方法是先进行大量元素的配置，称量时应注意多余的药品不能回放在瓶中，应做其它处理。电子天平在使用时先对其进行调平，然后进行微量元素母液，有机物母液的配制。当MS母液配好以后，则可进行培养基的制作，将母液按称取量计算好后进行吸取，然后转入1L的容量瓶再加激素母液进行定容。继之对琼脂和蔗糖进行称取、溶解，当容器加热至0100时，可将糖加入其中，在4060时加入琼脂。待水沸腾后进行补水，用氢氧化钠对PH进行调整至溶液完全沸腾后停止加热。进行分装，一般以50ml为宜，分装后应立即进行灭菌。1.3外植体的采集及接种1.3.1外植体的采集无菌培养物的建立关系到整个生产系的建立，外植体的采集非常重要。外植体的采集是依据不同的培养目标而异。但不论哪类，都应选择最能表达全能性的部位，以降低生产成本，通常往往选取一些生长健壮的当年生枝条、饱满而未萌芽的侧芽作为外植体。其取材季节对于大多数植物而言，都应在生长开始的季节采样。对于利用茎尖培养的植物一般材料越小成活率越低，所以茎尖培养成活的临界大小应为一个茎尖分生组织带12个叶原基，约为0.20.3mm；叶片、花瓣等约为5mm，茎段长约0.5cm，例如兰花、香石竹。1.3.2外植体的清洗待外植体采回后，先用流水冲洗半小时左右，使其表面吸附物消除，在转入其他容器中加上洗涤剂进行清洗；在将易感染的各部分剥去、洗净，再切去上不幼叶。1.3.3消毒与接种接种是组织培养是否成功的关键因素。接种前必须对接种室、接种人员，接种材料进行彻底的消毒与灭菌。针对外植体的灭菌处理，则先将外植体在75%的酒精中浸19s，再用蒸馏水冲洗三次。再剥取23片叶，放入5%次氯酸钠水溶液5min，再用无菌水冲洗，剥至留下最后一枚叶片，以生长点为中心切去0.30.4cm的方块。外植体经消毒接入MS+6-BA3.0mg/l+IBA1.0mg/l+GA30.5mg/l或MS + 6-BA 1.5 mg/l + NAA 0.5mg/l+IAA0.5mg/启动培养基中，6-BA为4mg/l时诱导出花芽，在B5+6-BA 1.0mg/l+ NAA3.0mg/l+GA3.0mg/l的培养基中，则诱导产生簇生的原球茎。1.3.4培养 培养温度为2025，每天1216h，光照强度为10002000Lx。2.继代增殖经适宜培养后，约46周后可在外植体周围形成许多球状物，即原球茎，将其分割接入（MS+6-BA0.5mg/l+IBA0.1mg/l）2000ml培养集中，以促使嫩茎长出更多的原球茎，从而分化培养成苗。切取茎尖时要带两个左右叶原基，茎尖大小对增值速率也有影响，同时，继代周期对原球茎增殖也有影响原球茎随继代周期的延长而增加。2.1试管苗生根壮苗培养在生根培养基中，转入单株生长或单株丛生的无根小苗培养其生根，草本植物7d左右即可生根。生根培养基多采用1/2MS培养基，加入适量生长素。当小植株生出35条水平根，每根长23cm时为最适宜的出瓶炼苗阶段。由胚状体发育出的小苗，有时还需低浓度植物激素的培养基培养，以便更进一步壮苗，移栽前的壮苗培养阶段时必需的。通常将其从根状茎基部切下转入壮苗培养基中培养，培养温度提升至28，当苗长至12cm高，具有34片真叶时就可以移栽。2.2试管苗的驯化移植试管苗驯化移植是组培快繁的重要环节。移植前可将培养瓶在自然光下炼苗15-20d，以使其感受温差现象。更好壮实，之后再开瓶移植。2.2.1移植移植时洗去根部的琼脂，置于阴凉处，待苗木阴干后，就可以移植到通气、透水，保湿介质中。2.2.2移植后的管理中国兰属地生兰类，最忌土壤积水，以免引起根系腐烂。栽培中国兰宜选择空气流通而清新的地方，栽种温室最好要全玻璃面得，室内应保持足够的室内湿度，且应注意适度通风。放置兰盆的台架可用木材或钢材制作，以利盆地通风防止烂根。对于夏季的兰花需搭建荫棚，其荫蔽度在50%60%之间比较好。北方多在30%左右春兰、建兰、蕙兰要光稍多于墨兰、寒兰。2.2.3移植后植保工作故人有“干兰湿菊”的说法，这主要是指兰盆内土壤不宜过湿，其具有较强的耐寒能力。兰花在冬季进入相对休眠期时，盆土以微潮较好，从春季开始，随温度的回升应加大灌水量。兰花用水以无污染，微酸（PH5.56.5）为好，以雨雪水为上。兰花的根没有须根，根内有共牛菌。一般基肥多与培养土混合使用，通常用腐熟的干牛粪按1：10加入培养土，并加入少量磷肥。此外，还可施行追肥，每次少施约两周施一次。也可用氮、磷、钾比较全面的化肥，其浓度应在0.0025%0.1%，是普通草本花卉的1/21/4的用量。兰花最忌施肥过量，对于生长健壮的可多施，而对生长软弱、发生过腐烂病的必等完全恢复后再施入。3.影响兰花原球茎增殖的因素3.1基本培养基成分对茎增殖的影响如无菌培养物墨兰，其喜欢在高盐基质中生长，因而MS作为基本培养基最好，增殖培养时PH以5.0左右为好，光培养增殖效果比暗培养好，每天光照15h。3.2激素的影响 一般情况下当生长素/细胞分裂素1时有利于生根，生长素/细胞分裂素1时有利于生芽，若二者浓度相当时，利于形成愈伤组织。3.3切割方式对其影响 在原球茎切割方式中，掰开（自然分离）比横纵切好，因为掰开时其损伤小，成活率高，而切开的则易发生褐变。3.4活性炭在培养基中加入活性炭的主要目的是利用其吸附能力，减少有害物质的影响。在培养基中加入0.3%活性炭，不仅可以促进生根，还可以抑制褐变。3.5含糖量及培养基硬度的作用 培养基中最常用的碳源是蔗糖，其浓度为2%3%，蔗糖对胚状体的发育期重要作用。培养基的硬度由琼脂用量决定，在培养基中加入量的多少对培养物增殖有很大的影响。琼脂过多时培养基过硬，影响养分的吸收，使苗木的生长速度减慢。一般情况下，随着琼脂浓度的增加，其玻璃化比例明显下降，从而大大提高苗木增殖量。3.6继代周期的影响 例如建兰在MS+6-BA0.5mg/l+IBA0.1mg/l的培养基上，其培养时间为20d。通常原球茎随继代周期的延长而增加，变异频率也会不断提高。所以其最佳继代周期为20d。4.影响兰花生根和移栽成活的因素4.1活性炭有否对兰花生根的影响活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应，在培养基中加入活性炭，不仅可以促进生根、防止褐变，还可以降低玻璃苗的产生频率。4.2生长调节物质的不同种类及浓度比例的影响生长调节物质主要有生长素、细胞分裂素、赤霉素等，其中生长素中NAA对诱导生根和提高移栽成活率效果最好，其浓度为0.110mg/l。4.3试管苗的生理状况 其是影响移栽成活率的内在因素，同一种植物的试管苗，其装妙笔弱苗移栽后成活率高。4.4无机盐浓度 实验结果表明，降低无机盐的浓度对植物生根效果较好，有利于驯化成功。利用兰花是世界珍贵名花，随着各国人民经济的发展和生活水平的提高，对兰花需求的日益增加。20世纪60-70年代，兰花工业应用而生，出生产兰花外和配套生产兰花盆景、兰花苗、兰花农药、专用肥及事物等。5.兰花组培的应用5.1快速繁殖优良品种实践证明，植物组织培养是快速繁殖培养优良品种的有效手段，并在克服远缘杂交不亲和性、种质资源的保护、杂种胚发育不良等都具有重要价值。同样兰花在组培快繁中也有很高的应用价值。兰花是最早开展组织培养研究的植物之一，也是研究最多发展最快的科属之一。5.2建立无病毒株系一般通过组培技术建立无病毒株系，快速繁殖生产无病毒苗木，采用兰花的茎尖组织培养，就可以脱除病毒。5.3种质资源的保存与交换随着WTO的加入，花卉种质对外交流频繁发生特别是对于兰花具有丰富种质资源，栽培技术要求较高的物种，采用组培技术保存其种质资源，足可为其带来一次新的飞跃。6.兰花病虫害防治 6.1兰花主要害虫及有害动物6.1.1蚧壳虫 兰花最常见的害虫，主要寄生于兰花的茎和叶上。可用人工防治和药剂防治的方法以减轻虫害度。6.1.2红蜘蛛 这种情况一般在光线强、温度高的地方发生。 通常危害叶片，使其呈现灰色坏死斑，在栽培中应注意通风保湿。6.1.3潜叶蝇 危害叶片、并易产生黑腐病，常用喷洒药剂的方法来防止。6.1.4粉虱 危害叶片角质层，易引起褐腐病，常喷洒80%敌敌畏或40%的乐果等。6.2兰花主要病害6.2.1兰花幼苗病害 兰花幼苗从试管