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单克隆抗体制备技术杜双利 2012100071 生技基 摘要：单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，其在基因和蛋白质的结构与功能研究方面有着不可或缺的作用。本文综述了单克隆抗体制备技术历史、现状、最新进展研究、应用等，并且还同时介绍了一些重要的制备技术，包括嵌合抗体、噬菌体展示技术、核糖体展示技术、基因工程抗体等。 关键字：单克隆抗体；制备技术；最新研究进展；现状与展望The monoclonal antibody preparation technology Abstract:Monoclonal antibody technique, as an important tool in modern life science research, plays an indispensable role in the study of gene structure and protein function, as well as in the immunological diagnosis of humans, animals and plants. This review gives an overview on the monoclonal antibody preparation technology, about history, present situation, latest research, application etc.And also introduce some important preparation technology,such as chimeric antibody, phage display，ribosome display, genetically engineered antibody, etc. Key words: Monoclonal antibody；Preparation technique；Latest research；Situation and forecast 1、单克隆抗体制备技术的研究背景 1975年德国科学家Kohler 和英国科学家Milstein 利用杂交瘤技术将产生抗体的B 淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术，由于单克隆抗体在生命科学领域的巨大贡献，此技术获得1984 年的诺贝尔医学和生理学奖；在1994年Winter 等创建了以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程抗体，是单克隆抗体技术的又一重要进步，该技术是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，使不经免疫既可获得任何一种动物（包括人）的特异性抗体成为可能，目前基因工程抗体在疾病的预防、诊断、及治疗方面已获得广泛应用。 单克隆抗体的制备原理就是：动物受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应抗体。这一职能由B淋巴细胞承担；肿瘤细胞在体外培养条件下可以无限传代是“永久”的细胞，而为了制备大量纯一的单克隆抗体,Kohler和Milstein设计了如下方法：小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)在聚二乙醇或灭活病毒的介导下融合。融合后杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌抗绵羊红细胞的抗体；另一方面像肿瘤细胞一样，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。2、单克隆抗供体制备技术的介绍 2、1传统的单克隆制备技术 2.1.1杂交瘤技术-鼠源单抗 该技术主要包括免疫动物、细胞融合和杂交瘤细胞的筛选三个环节。 2.1.1.1免疫动物 目前常用BALB /C 小鼠，也可用SC ID 小鼠( severe conbined immumdef iciemym ice)、转基因小鼠、转染色体小鼠，用特定的外来抗原一次或多次免疫动物, 刺B 淋巴细胞增殖形成浆细胞，分泌针对该抗原的抗体。 2.1. 1. 2 细胞融合 常用骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合, 通常采用PEG 法或PEG 电融合法, 该法稳定, 安全简单; 也有报道用小鼠的腘窝淋巴结细胞和骨髓瘤细胞融合, 5 周内成功产生抗病毒的小鼠单抗。抗体，即“单克隆抗体”。细胞融合培养时加入HAT(H一次黄嘌呤、A一氨基喋呤、T-胸腺嘧啶)选择系统，目的是保证只有杂交瘤细胞的生长。融合细胞能在HAT选择性培养基上生长的原理是：在HAT系统中。A阻断了核酸合成的主要途径，这时正常细胞可以通过“补救途径”，由胸腺嘧啶激酶(TK)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)利用T和H合成核酸。骨髓瘤细胞，因缺乏HGPRT不能利用“补救途径”，所以在HAT系统中不能存活。而骨髓瘤细胞和脾细胞的杂交细胞，从正常的脾细胞获得了HGPRT，能够存活。正常脾细胞没有在体外长期生长的能力。 2. 1. 1. 3 杂交瘤细胞筛选 HAT选择培养基有3种关键成分: 次黄嘌呤( hypoxanthine, H )、甲氨蝶呤( am inopterin, A )和胸腺嘧啶核苷( thym id ine, T ), A是二氢叶酸还原酶抑制剂, 可阻断核酸合成的主要途径。B淋巴细胞可通过补救途径, 由胸腺嘧啶激酶( thymidine kinase, TK )和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶( hypoxanthineguan ine-phosphoribosy trans ferase, HGPRT)利用T 和H 合成核酸, 但不能在体外长期生存; 骨髓瘤细胞缺乏HGPRT, 不能在该培养基中生长; 杂交瘤细胞具有B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性, 在HAT培养基中长期生存又可产生抗体, 成为制造单克隆抗体的细胞源。 单克隆抗体制备技术，除了以上寻找免疫动物、细胞融合和和杂交瘤细胞筛选外，我还认为，筛选出单克隆抗体的细胞后，为了要把它应用到工业生产当中去，那么就还要包括对获得的单克隆抗体的细胞进行大规模的培养，得到许多的细胞株，检测细胞的的活性达到95%以上后，对其进行冷冻保存，在要用的时候复苏细胞培养大量的细胞进行以后的步骤。这对那些特别重要的单克隆抗体细胞来说显得非常重要。这样使得制得的单克隆抗体细胞能够持久的使用，减少许多的麻烦。 这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特征。既能在人工培养下无限增殖又能产生特异性的抗体。由于每一个被免疫的淋巴细胞只能对某个单一的抗原决定簇产生特异性抗体，因而在将其克隆化后产生的单克隆细胞系，就能产生大量单一的高纯度抗体，即“单克隆抗体”。 2.1.1.4 杂交瘤技术的优缺点 由于单克隆抗体是单细胞繁殖的细胞所产生的抗体，具有特异性强，纯度高，可以大规模工厂化生产等优点，从而使免疫分析技术准确性高，重复性好，方法简便。 但McAb技术所需仪器设备昂贵，加之实验程序较为复杂，又因单克隆抗体针对某一抗原决定簇，抗原化合价常常不能与抗原形成网络沉淀，不能用于沉淀衍生出来的免疫技术。此外，单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源单抗用于人体治疗时存在诸多问题：鼠源单抗在人体中常不能有效激活补体和Fc 受体相关的效应系统；被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody, HAMA）反应；且在人体循环系统中很快被清除。这使得单克隆抗体技术研制成功后在临床应用方面进展缓慢。 由于杂交瘤细胞制备技术的一些缺陷，科学家们便在不断地改进并且改造其他技术来在一些领域上和方面来弥补杂交瘤制备技术上带来的问题。于是便有了以下这些技术的诞生，这些技术可有效的解决传统杂交瘤技术所存在的问题，为单克隆抗体的应用提供更广阔的空间。 2、2 单克隆抗体制备技术的现状和进展 近年来，随着分子生物学的发展，出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术所制备的单克隆抗体。这些技术的出现进一步的扩大了单克隆抗体的范围，推广了单克隆抗体的应用。 2.2.1 嵌合抗体 嵌合抗体产生于1980 年代中期，是将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区, 应用DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物,选用适当的抗生素或试剂进行筛选, 再用与传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。但这种抗体仍保留了原来鼠源抗体约30%左右的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应（HAMA）。 为了进一步提高嵌合抗体的人源化，在嵌合抗体的制备过程中又引进了重构抗体技术和表面重塑技术以提高抗体的人源化。重构抗体是与异源抗体和抗原的结合相关的；而表面重塑抗体技术是对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸进行替换。所替换的片段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构像的残基要尽量保留。 到目前为止，嵌合单克隆抗体基本主宰着治疗性单抗的商品市场，嵌合抗体的制备技术也不断发展，抗体人源化程度也不断提高，但是即使是在仅移植不到整个嵌合抗体5%的鼠抗体互补决定区(complementarity determining reign, CDRs) 的情况下，鼠源成分依然存在，并未完全解决鼠抗体的免疫原性问题,而且人源化过程较复杂，造价也比较高。 2.2.2 人源化抗体 人源化改造主要是重构抗体和表面重塑抗体。 重构抗体分为互补决定区( complementarity determining region，CDR) 移植抗体和特异性决定残基通过分子克隆的方法，克隆到人抗体相应的框架区。仍残存少量异源基因，仍可引起免疫排斥反应。并不是整个CDR 都参与抗原的特异性识别，在CDR 区中仅一部分氨基酸残基与抗原结合，这些氨基酸残基决定抗体的特异性，被称之SDR。SDR 移植抗体仅将异源抗体CDR 区内与抗原结合关系密切的SDR，移植到人抗体相应位置上，使人源化抗体的免疫原性进一步降低。但SDR 移植抗体和CDR 移植抗体一样往往存在亲和力和特异性降低的缺点。目前重构抗体是对鼠源性单抗人源化改造最常用、最基本的方法。 表面重塑抗体是对鼠抗体框架区表面氨基酸的残基进行重塑或替换，该技术仅改造或替换与人抗体有明显差异的表面氨基酸的残基。在维持抗体活性和减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸残基替换，使抗体与抗原结合具有更好的亲和力和特异性。 2.2.3 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术是抗体库筛选技术的主要手段，而噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。 20 世纪80 年代Smith发现了可以分离基因的噬菌体展示技术。噬菌体展示技术建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上。该技术属于体内展示技术, 其原理是通过RT-PCR 克隆扩增人淋巴细胞谱中的VH 和VL基因片段，导入噬粒，转化细胞，建立噬菌体抗体文库，此时噬菌体核心DNA 中有编码人抗体VH、VL基因片段，所编码蛋白与噬菌体膜蛋白相连，分布于噬菌体表面。可通过多次“ 吸附-洗脱- 扩增”， 筛选出特异性的全人化抗体可变区基因。 抗体的制备方法是：将抗原包被在固项介质上，加入待筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合，获取结合的抗体，将未结合的抗体洗脱，从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒去感染宿主菌，使该噬菌体颗粒得到扩增，将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。 作为迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术，噬菌体抗体库具有以下特点：最大的特点是实现了基因型和表型的统一；表达的是完全人源的抗体，且主要以活性片段scFv、Fab等形式表达，组织穿透性和抗原结合性都比完整抗体具有明显优势；经过多次“吸附一洗脱一扩增”的富集过程，可以筛选得到特异性的抗体基因；筛选容量大，杂交瘤技术的筛选能力一般在上千克隆以内，而采用抗体库技术可以达到106以上的克隆；用途广泛，利用噬菌体展示技术筛选出的抗体具有特异性高、容易保存、生产周期短、易于大批量生产等特点，在大规模的工艺化生产中显示出明显优势。2.2.4 核糖体展示技术 核糖体展示技术是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的技术。 1994年，Mattheakis等建立了一种体外核糖体展示随机肽系统，利用“多肽一核糖体一mRNA”复合物将肽库构建在多核糖体上，借助多核糖体在体外将基因型和表型联系起来。1997年，Hanes和Plukthun等在此基础上加以发展和完善，建立了核糖体展示技术。它的基本原理是通过PCR扩增目的基因的DNA文库，同时加入启动子、核糖体结合位点及攀环，并置予具有耦联转录翻译的无细胞翻译系统中孵育，使得目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面，并形成“mRNA一蛋白质一核糖体”三元复合体，最后通过常规的免疫学检测方法，通过同相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用RTPCR扩增，经过多次循环过程，最终筛选fl高亲和力的目标分子。 由于核糖体展示技术是纯粹的体外系统，核糖体展示技术可以克服其他展示技术所不能解决的问题。首先，核糖体展示技术具有库容量大的优点，库容量可达到10121015，分子文库的筛选结果与库容量具有正相关的关系，所以能更容易筛选到目标分子。其次，核糖体展示技术不需要考虑细胞毒性，在体内表达系统中，考虑到大肠杆菌宿主菌的生长，具有毒性的蛋白分子无法通过此方法表达，这个缺点在体外展示系统中可以被克服。由于核糖体展示技术是完全体外系统，因此避免了体内体外操作的转换，只通过PCR 就可进行所有复制与扩增，几个小时就能够建立核糖体展示文库，因此还具有建库周期短，筛选简便等优势。 2.2.5 RNA-多肽融合技术 RNA-多肽融合技术也被称为mRNA 展示技术或是体外病毒技术。1997 年Roberts 和Szostak14与Nemoto15分别独立设计了这种与核糖体展示类似的方法。这个展示系统是利用嘌呤霉素分子将mRNA 分子和其所编码的多肽共价结合起来，嘌呤霉素与单链DNA 连接物的3 端连结，然后这个DNA 连接物再与文库编码mRNA的3 端连结。当mRNA 在体外翻译时，核糖体到达mRNA 和DNA 的结合点并稳定下来，嘌呤霉素进入核糖体的氨酰化位点，并在氨酰转移酶的作用下与所编码的多肽偶联。mRNA-DNA-嘌呤霉素分子文库可在体外翻译，然后用固相化的靶分子将纯化的RNA-多肽复合物淘选出来，像核糖体展示系统那样，这个复合体可通过RT-RCR 得到进一步的扩增。 2.2.6 基因工程小鼠制备全人抗体 制备全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠( hu-PBL-SCID 小鼠) 、基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。 hu-PBL-SCID 小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠，经抗原免疫后可获得人源抗体。转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因( 或基因组片段)导入小鼠的受精卵( 或着床前胚胎细胞) ，然后将此受精卵( 或着床前胚胎细胞) 再植入受体动物的输卵管( 或子宫) 中，使其发育成携带有外源基因的转基因小鼠，将编码人抗体的基因序列转化鼠细胞已形成转基因鼠，在抗原的刺激下，该转基因鼠可分泌合成人抗体。由转基因小鼠产生的McAb 经历了正常装配和成熟的过程，产生的抗体具有较高的亲和力。转染色体小鼠是通过微细胞介导法( MMCT 方法) 将人14 号染色体上产生IgH 的胚系片段和2 号染色体上5 50 Mb 的 轻链片段转染到ES 细胞，获得小鼠经人血清清蛋白免疫之后，可产生抗人血清清蛋白的人Ig，再次免疫后产生IgM。 2.2.7小分子抗体 常用的小分子抗体有单链抗体、重组Fab片段、单域结构、双特异性抗体、免疫粘连素、催化抗体等。单链抗体由一段编码连接肽基因连接抗体的重、轻链的可变区基因( variab le reg ion heavy chain, VH、variab le reg ion ligh t chain, VL)表达形成的重组蛋白；双特异性抗体是由氨基酸残基连接起来的两个不同小分子抗体，能够结合两种抗原，介导标记物与靶抗原的结合或某些效应因子定位于靶细胞； 免疫粘连素是由Ig恒定区基因连接人细胞受体或粘附分子基因， 在真核细胞中表达的融合蛋白。小分子抗体分子量小、穿透性强、抗原性低、半衰期短， 可在原核系统表达，易于进行基因工程操作，因此受到广泛重视。 总的来说，不论是噬菌体抗体库技术，还是嵌合抗体技术等，这些技术的基础还是杂交瘤细胞计数。这些单克隆抗体制备技术的基本步骤还是差不多的，即要选择正确的免疫动物，进行细胞融合和筛选所需的单克隆抗体等步骤。这些技术都是的杂交瘤细胞制备技术的基础上，在细胞进行融合前进行一些更加完善、适用、简单和符合工业生产的改进，使得融合后的细胞能够具有更多特性，更多功能。因此这使得单克隆抗体的运用范围更加的广泛，能够解决更多的疾病问题。3、 单克隆抗体制备技术的应用 单克隆抗体制备技术的发展为临床疾病的治疗开辟了一条新的思路。制备具有出度高、特异性强的单克隆抗体可以准确的作用于目标，在VMC模型大鼠的治疗取得一定进展，并可能提供缓解心肌炎的严重程度的一种有效的治疗方法。然而一些问题任然存在，没有完整的降低毒性心肌炎的症状的单一的抗体。 用单克隆抗体制备技术可制备一些治疗疾病的单克隆抗体。制备用于骨髓移植治疗白血病、淋巴瘤、肿瘤等的单克隆抗体。制备用于诊断疾病和检测试剂的单克隆抗体：将艾滋病毒提取出来制成单抗，并将单抗制成PH试纸一样大小的卡片。所以只要把一个小卡片放在口里就可以检测出是否患有艾滋病。这样则可很好地预防和检测艾滋病以及使患者能更早地接受治疗。 单克隆抗体制备技术的一个具体应用。制备黄绿青霉素单克隆抗体和制备检测开发鉴定IC-ELISA。黄绿青霉素（CIT），由青霉菌citreonigrum产生的神经毒素，一般全球范围内检测谷物和农产品，对人类和动物健康无数毒理作用。在研究中，已成功制备人工抗原CIT-KLH和CIT-BSA通过琥珀酸酐和碳化二亚胺的两步法。 CIT-KLH偶联物注射到Balb / c小鼠，并针对CIT抗血清的效价，用CIT-BSA作为通过ELISA法包被抗原测定。8D8稳定地分泌抗CIT单克隆抗体是通过融合来自经免疫小鼠的脾细胞和SP2 /0骨髓瘤细胞与产生的杂交瘤细胞系。再用杂交瘤技术对杂交瘤细胞系进行筛选和检测。 4、单克隆抗体制备技术的未来发展 单克隆抗体制备技术会在科学家们的不断探索与研究下，发现更多更加方便，适用广泛的制备技术，单克隆抗体制备技术将会在工业生产上生产更多的单克隆抗体，使得单克隆抗体类的抗肿瘤药物，诊断治疗和免疫疾病等，用的更加的多，并且价格降低。 全人单克隆抗体是制备单克隆抗体的一种新技术。它减少了鼠基因序列及抗抗体反应，提高了单克隆抗体的功效和安全性。虽然单抗药物还存在一些尚未解决的问题，最突出的问题是如何降低单抗的免疫原性，单抗的异源性所引起的抗体反应，不但降低了单抗的效价，而且会给患者带来严重的后果。但是随着抗体疗效不断提高，生产工艺不断成熟，单抗类药物必将为全球疾病患者带来更大的希望。因此，对异源性单抗进行改造以及人源性单抗的研制成为单抗研究的重要方向。 另外，我认为单克隆抗体制备技术在将来的发展会更加的集中到一些比较详细的疾病上去（例如：制备诊断传染病、免疫性疾病、内分泌性疾病的单克隆抗体），研究和利用单克隆抗体制备技术来开发更多种药物产品。迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术-噬菌体抗体库技术，将会发展的更加成熟，在单克隆抗体的工业化生产制备中将占有很重要的地位。 最重要的是找到能够解决从非人源抗体到人源抗体的完美转化的方法，完全解决鼠抗体的免疫原性问题，参考文献： 单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景 孔君，刘箐*，韩跃武，王天昌，刘金芝 免疫学杂志2011 年2 月第27 卷第2 期单克隆抗体制备技术及临床应用的研究进展 *张 华 胡成进 1. 泰山医学院免疫学教研室, 山东泰安 271016; 2. 济南军区总医院实验诊断科, 山东济南 250031) 泰山医学院学报 JOURNAL OF TA ISHAN MED ICAL