高效降解纤维素混合菌株的选育.doc

高效降解纤维素混合菌株的选育本研究从垃圾堆肥，腐烂稻草，秸秆，树叶植被覆盖的土壤中采集，采集地点在学校工厂周围，天气阴天，周围环境干燥。根据多过采样点来弥补菌种种类少的缺点，更加有利于我们以后菌种来源广，酶系组成更全；利用菌种之间存在的共生特性，将不同的菌种进行混合培养进行发酵，以弥补单菌酶组分不全，活性不高的弱点。分离筛选路线图样品采集富集培养 滤纸崩解测试分离纯化 初筛 单菌筛选 刚果红识别组合单菌 复筛 产酶测试固态产酶测试确定目标混合菌目标混合菌鉴定紫外线诱发突变 固态产酶测试 1富集培养富集培养基 KZHPO40.2%， (NH4)25040.14%， MgS04.7HZO0.03%， CaC120.03%，Feso4 7HZo5x10一4%， Mnso4i.6xio一4%，znso4i.7xio一4%，eoel22xio一4%，滤纸条2%，pHS.5，i21oC灭菌3omin。富集培养是在目的菌种含量比较少时，根据能够分解纤维素菌种的生理特性，设计一种选择性培养基，创造有利于该菌种生长条件，使目的菌种在适合的环境下迅速的生长繁殖，数量增加。有利于分离到需要的菌种。把各种样品向各品瓶中注入50mL左右的无菌水，加玻璃珠充分振荡，以洗下样品上的微生物，静置，三层灭菌纱布过滤，再静置，取滤液中的上清液lmL接种于250mL装有增殖培养基50mL的三角瓶中。随后将装有含取样菌增殖培养液的锥形瓶置于摇床上以300Or/min、30培养72h。培养结束之后，再将其中的滤纸转入无菌的新鲜增殖培养基中，反复3次，使利用纤维素的菌株得到富集。2菌株分离2、分离平板培养基梭甲基纤维素培养基(CMC培养基):CMC一 Na15克， NH4No3 1克，酵母膏1 克，Mgso4 7H2o 0.5克，KH2Po4;1克 H2O 1000mL，琼脂2%，pH自然，121oC灭菌30min在富集培养之后，为进一步分离纯化目的菌株1、移取富集培养液0.lmL于CMC一Na培养基上作平板涂布，30恒温培养。待平板上长出菌落后，立即挑取，并在CMC一Na平板上进行划线分离，随后将长出的单个菌落接种于斜面培养基上进行保存。2、从富集培养液中挑取己溃烂的滤纸片点种于CMC一Na培养基平板30恒温培养，观察培养基上滤纸的形态变化，及其菌株的生长状况通过对采集到的样品进行富集培养，并分别对其形成的富集培养液进行平板涂布、划线分离，共分离得到单菌15株。3各菌株的形态特征菌种编号形态特征1菌落呈圆形放射线状，白色干燥。2菌落白色绒状，菌丝体覆盖整个平板，且干燥。3菌落最初为白色绒状，而且呈颗粒固体状态，后逐渐变为青色，最后全部变为青色，且干燥。4菌落圆形初为白色，约72小时后变为黄色，湿润。5菌落圆形 初为白色，22小时后菌落中心出现青黑色，菌落圆形干燥。6菌落白色绒状向外辐射，干燥培养一短时间变为咖啡色7菌落呈丫枝状向外辐射，为白色8单菌落为白色，较大的圆形，干燥。9菌落极细小的白色圆形，湿润，密布于怎个平板。10菌落初为白色，细小的圆形，湿润。11菌落为浅黄色，极细小的圆形，比较湿润。12菌落为圆形，黄色很湿润，易挑取。13菌落为白色，在菌落周围有一圈白色水圈，14菌落为白色，菌落中有一条螺旋线条15菌落呈绒状白色通过菌种分离得到15种细菌，把每一种菌种分别放入250ml的锥形瓶中再一次通过富集培养，培养情况如下表组号时间滤纸条分解情况效率%172小时滤纸条分解但是不完全80%272小时滤纸条分解但是不完全56%372小时滤纸条分解完全100%472小时滤纸条分解但是不完全88%572小时滤纸条分解完全87%672小时滤纸条分解但是不完全90%772小时滤纸条分解完全100%872小时滤纸条分解但是不完全75%972小时滤纸条分解但是不完全94%1072小时滤纸条分解完全100%1172小时滤纸条分解完全100%1272小时滤纸条分解但是不完全89%1372小时滤纸条分解完全100%1472小时无变化01572小时无变化016对照组72小时无变化0根据实验对比可知14和15组细菌不能够产生分解纤维素将的酶。1、 滤纸崩解测试滤纸条鉴定培养基（NH4)SO4;0.10%，KH2PO4;0.10%， MgSO4.7H2O0.05%，K2 HpO40.2%，酵母膏0.01%，滤纸条 (1X7cm)一块，pH自然。将滤纸条培养基的液体部分分别装入数支试管中，每支2mL，并投入一块50mg(大约 1X6cm )的滤纸条(滤纸经烘干后称重)，灭菌后备用。挑取不同形态的菌落分别接种于滤纸条培养基的滤纸条上，于30恒温培养。在CMC培养基上作平板划线分离，30培养72h后，再将长出的单个菌落接入滤纸条培养基中培养10天，将接种10天后的滤纸条用水轻轻洗涤，烘干后称重，计算出失重率。2、 刚果红纤维素平板识别刚果红纤维素鉴定培养基: (NH4)2SO40.2%，MgSO4.7玩 00.05%， KHZP040.1%， NaCI0.05%，CMC一Na2.0%，刚果红0.02%，琼脂2.0%，pH自然。分离得到的13个单菌菌落分别进行滤纸崩解试验和刚果红鉴定，测定结果见表菌种编号12345678910111213滤纸失重率（%）1153215162238122531361730溶解圈/菌落0.550.270.780.680.700.780.910.690.750.710.780.700.804酶活力的鉴定（1）产酶培养基(g/L)稻草粉90%、鼓皮10%+营养液，比例为59固体加入15mL营养液，pH自然，121oC灭菌60min51。（2）营养液(NH4)250;2%，KHZpO;0.1，MgS04.7HZO0.5%，CaCI:0.01%，NaCI 0.01%， FeS04.7H200.005%， MnSO4.HZO0.0016%， ZnS04.7HZO0.0014%，CoC12 0.002%。（3）稻草的预处理先将取得的稻草烘干，剪切至3cm左右，粉碎过40目。然后，将稻草粉置于4%Na0H溶液100水浴 15min，取出用两层纱布包裹在自来水上冲洗掉碱液，并用盐酸调节pH值至5.0左右。在105下烘干备用。（1）试剂及缓冲液(l) 二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):将7.5克3，5一二硝基水杨酸和14.0克的Na0H充分溶解于1000mL水中，加入216.19酒石酸钾钠，5.4mL预先在50水浴中溶化的苯酚和5.99偏重亚硫酸钠，充分溶解后置于棕色瓶中，室温下放置一周后使用153。(2)pH4.8醋酸一醋酸钠缓冲液。吸取20mL0.Zlnol/L的醋酸和30毗0.Zmol/L的醋酸钠混匀 (3)0.1%葡萄糖标准溶液。分析纯葡萄糖105干燥到恒重后，准确称取100mg，用少量蒸馏水溶解并定容至100mL，冰箱保存备用。(4)1.omol/LHCL溶液、1.omol/LNa0H溶液。（2）葡萄糖标准曲线制作取8支比色管，分别按表3.1顺序加入各种试剂，将各管溶液混匀后，在722分光光度计上(52Onm)进行比色测定，用空白管溶液调零后，测定各管光密度值。以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，得标准曲线 葡萄糖标准配制项目对照空白1234567含糖总量（mg）00.20.40.60.81.01.21.4葡萄糖液（ml）20.20.40.60.81.01.21.4蒸馏水（ml）21.81.61.41.21.00.80.6DNS试剂（ml）22222222光密度（OD）00.0900.2610.4780.6360.8081.0061.200葡萄糖标准曲线y = 0.9218x - 0.0993R2 = 0.999400.20.40.60.811.21.400.511.5葡萄糖量(mg)光密度(OD)光密度（OD）线性 (光密度（OD）)由所得数据可以看出，吸光度值与葡萄糖含量呈线性正相关，随着葡萄糖含量的增加吸光度值也直线递增，因此只要绘制出二者的关系图利用Excel软件处理数据得标准曲线回归方程:Y=0.9218X一0.0993，线性相关系数R2为0.9994.（3）滤纸酶活(FPA)测定分别于A、B试管中加入pH4.8醋酸一醋酸钠缓冲液1.omL，及滤纸片(10mmX60mm，约SOmg)各一张，A试管中加入0.5mL适当稀释0.01的酶液(经预热)，保温60min后取出加入1.5mLDNS试剂，B试管中补加0.5mL酶液，摇匀后于沸水浴中煮沸8min，取出置于冷水中冷却至室温，而后加入蒸馏水稀释至25mL混匀后在520nm波长处进行比色(B试管作为空白对照)，测出OD值，查阅标准曲线后，求出溶液中的葡萄糖含量。 根据酶活计算 酶活单位(U)=G*N*60*1000/(o.5*T*MG)葡萄糖拜mol/(mLhsooC) （4） 根据实验得出光密度OD菌种编号12345678910111213时间5d5d5d5d5d5d5d5d5d5d5d5d5d分光度OD0.13690.07260.62030.24180.29540.17230.48720.10380.20320.25840.26870.23890.4053葡萄糖（mg）0.25650.186480.780660.370080.42820.294660.63630.220320.328140.388080.399240.366840.54378酶活umol/(mL.h)14.2510.3643.3720.5623.7916.3735.3512.2418.2321.5622.1820.3830.21根据上实验数据可以看出13组数据可以看出，第3 ，7 ，13 的酶活是最强的前三组，分别是43.37 umol/(mL.h)，35.35 umol/(mL.h) 和 30.21 umol/(mL.h) 明显高于其它组的酶活，因此我们选择第 3 ，7， 和13组进行两两组合，因此本试验要继续筛选出降解效果最好的混菌组合。由于天然单菌酶组分单一、配比不均衡，将不同菌种进行混合培养，优势，互补，有利于完善纤维素酶组分，菌种来源广，酶系组成更全；利用菌种之间存在的共生特性，将不同的菌种进行混合培养进行发酵，以弥补单菌酶组分不全，活性不高的弱点。确定了三种混菌组合分别为 37 ，3&13 ，7&13分别测定产酶情况，筛选最佳菌种组合。（5）各混合菌的产酶状况 把每一组组合菌株分别以1:1 接入产酶培养基中，培养时间都为5d，最后通过滤纸酶活(FPA)测定测出OD值，查阅标准曲线后，求出溶液中的葡萄糖含量 菌种编号3&73&137&13时间5d5d5d分光度OD0.502280.740544.5615葡萄糖（mg）0.555660.814140.50562酶活umol/(mL.h)30.8745.2330.87人为将两种天然菌混合在一起培养，使产酶效果达到最佳，降解效率达到最