1.SOP western blot.doc

western blot操作步骤一、从活体组织细胞或培养细胞提取蛋白质A.提取蛋白：先剪碎组织或用胰酶游离细胞，再加PBS缓冲液混匀后离心，500g,4，5min,弃上清液；充分裂解细胞后离心，取上清；然后进行蛋白定量。例如：小鼠腹腔巨噬细胞的取法(富集细胞获得细胞清洗细胞裂解细胞收上清液)材料：消毒的手术器械（剪刀镊子）无菌PBS 一次性注射器 离心管 裂解液（1%裂解液=1mlTriton100+100mlTris-Nacl，PMSF用时加）1.富集小鼠腹腔巨噬细胞，提前3-5天向每只小鼠注射2ml高压灭菌的硫代乙醇酸钠（3%-5%，粉末溶于水）；2.3-5天后，断颈处死小鼠，用75%的酒精将小鼠全身喷湿（以免有鼠毛污染），置于超净台的蜡盘上。用一次性无菌注射器吸取5ml无菌PBS注入小鼠腹腔中，用手指上下揉小鼠腹部，使巨噬细胞混入PBS中，用镊子捏着小鼠腹部皮肤，用剪刀在腹部表面剪一小口，撕开表皮，露出覆膜，用注射器将腹腔中的液体吸出（注射器针头朝外，避免吸到内脏），如一次取不完全，可重复一次；3.将取出的巨噬细胞收于无菌离心管中，4，500g离心5min；若有红细胞，用无菌ACK裂解，5mlACK重悬细胞，室温静置3min，加PBS至30ml，4，500g离心5min。4.弃上清，10%FCS 1640培养基重悬细胞，于显微镜下计数，将细胞调到1.5-2x106cell/ml，96孔板铺板1.5-2x105cell/well,即100ul。如加药物刺激，配置一定浓度，但终体积均为200ul。5.补水 这也是很关键的步骤，为防止培养基蒸腾作用对实验的影响，实验组必须在板子内部，最外围一圈全部用无菌PBS补全，200ul/well.6.裂解细胞 重复步骤3，弃上清，每孔加100200ul裂解液，裂解1530min, 4，500g离心5min;24-48h收上清，小心吸取，不要吸到细胞（150ul左右）。如若一次用不完上清，可冻存到-20，用时融化。B.蛋白定量：BCA法或考马斯亮蓝染色测蛋白浓度例如：BCA法测定蛋白浓度 （BSA 2mg/ml，显色液200ul/孔，样品或标准品25ul/孔，OD=562nm）1(10ulBSA+40ulPBS)23456789123456789第一排BSA倍比稀释，绘制标准曲线；第二排测定未知样品的浓度。A:B:C=100ul:100ul:4ul二、 样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，简称Loading Buffer。我们用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。加入Loading Buffer后，100或沸水浴加热10min，以充分变性蛋白。 三、电泳(Electrophoresis)和转膜(1) SDS-PAGE凝胶配制：SDS-PAGE可以参考蛋白分子量的大小和蛋白需要的上样体积进行的配制。配胶的胶板可以分为1.0mm和1.5mm两种。1.0mm有10个加样空，每孔可以加入样品20ul。1.5mm的胶板可以配成10孔或者14孔两种，14孔的加样孔可以加入20ul的样品，10孔的可以加入30ul的样品。分离胶的浓度可以为10%，12%，15%依蛋白的性质而定，一般蛋白的分子量较小，选用浓度较大的胶。配胶时先配分离胶，后配浓缩胶，不同的胶配方如下：成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶51015203050蒸馏水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）8%胶51015203050蒸馏水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶51015203050蒸馏水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）12%胶51015203050蒸馏水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）15%胶51015203050蒸馏水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%胶2346810蒸馏水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris,pH8.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过硫酸铵0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01(2) 上样与电泳 配胶结束后，将胶板放入胶槽中，一定要夹好，两边的凹槽对好，不至于跑胶过程中漏电泳液。蛋白样品冷却到室温后，把样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。1.0mm的胶板用10ul的移液枪，1.5mm的可以用10ul或者100ul的移液枪。蛋白Marker单纯的SDS-PAGE可以加入3ul，如果转膜可以加入1-2ul。（通常电泳时，开始用80V电泳，使蛋白能够浓缩，一般约30min。30min后，蛋白到达分离胶，可以调电压到120。电泳的时间依蛋白的性质而定，一般Loading Buffer中的溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。电泳结束以后，将凝胶从胶板上剥下来，剥胶时，注意千万不要将薄的玻璃板撬碎。）（3）转膜(Transfer) 我们在Western实验中选用PVDF膜。 先将PVDF膜剪至和凝胶差不多大，或者清楚地知道蛋白的位置，可以将膜缩小，将目的蛋白盖住即可。膜在使用前，先用甲醇润湿，到膜呈通透为止。 SDS-PAGE中，通常加入SDS，可以使蛋白带有大量的负电荷，转膜时，将转膜夹打开，放在侵满转膜液的盘中，黑色的一边放在盘子下边，白色的在上。剪两块滤纸，大小和转膜夹两边的海绵一般。先将滤纸用转膜液侵湿，将一张滤纸放在海绵上，然后再放入凝胶，再盖上PVDF膜，再盖上一张滤纸，再加上海绵，最后将夹子夹上，放入电泳槽中。加入转膜液至转膜槽的顶端。中间滤纸，凝胶和PVDF膜之间不应有气泡。将转膜夹放入转膜槽中间，转膜夹黑色的一边对准转膜槽黑色的一边，白色的一边对准转膜槽红色的一边。(在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冷库或者是冰浴中进行转膜。转膜的时间也是依蛋白的量为标准，蛋白量大的可以多转一会，一般的转膜时间为2.5h即可。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。) 四、免疫检测封闭(Blocking) 转膜结束后，将膜夹出，放入5%的脱脂奶中封闭。封闭的作用就在于用脱脂奶中的蛋白，覆盖住PVDF膜中的非特异位点，避免抗体非特异性的结合到膜上，造成很高的背景。封闭时，将膜放在含有脱脂奶的自封袋中，用封口器将自封袋封好。然后再用胶布粘到静音混合器中，以使蛋白能够更好地封闭，一般整张膜，用6ml的脱脂奶封闭。封闭时间为室温2h或者过夜。（从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。）一抗孵育(Primary antibody incubation) 封闭结束后，加入一抗。一抗用5%的脱脂奶稀释，稀释度参照抗体的效价，一般按照1:2000加入。将膜放入到含有一抗的自封袋中，用封口器将自封袋封好，用胶带粘到静音混合器上，稀释的一抗一般加入3ml，孵育2h。2h后，将膜拿出，放在含有0.05%吐温的PBST溶液中，在脱色摇床上洗脱，15min换一次洗脱液，洗脱5次。二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 二抗一般用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 二抗也用5%的脱脂奶稀释，一般按照1:5000加入。将膜放入到含有一抗的自封袋中，用封口器将自封袋封好，用胶带粘到静音混合器上，稀释的一抗一般加入3ml，孵育2h。2h后，将膜拿出，放在含有0.05%吐温的PBST溶液中，在脱色摇床上洗脱，15min换一次洗脱液，洗脱5次。蛋白检测(Detection of proteins) 洗脱结束后，使用 Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。western发光液（简称ECL）由A液和B液1:1混合而成，一般一张膜加入1ml的ECL即可。将膜放在保鲜膜中间，ECL加入到膜上。将放有PVDF膜的保鲜膜放在暗盒中，将胶片放在保鲜膜上，关上暗盒。曝光的时间视荧光的亮度而定，荧光的亮度较小，则曝光的时间长一点，荧光较强，则曝光的时间短一点。曝光结束后，将胶片从暗盒中取出，取出时将胶片的一角剪去，以方便以后确定蛋白的位置。将其放在显影液中显影，2min后再用水将胶片上的显影液洗干净，再放在定影液中2min。2min后，将上面的定影液洗干净，重新放在暗盒中，标记好MARKER，烘干后拍照。试剂及缓冲液配制配制：1，1.0mol/L TrisHCl（PH6.8） Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所6.8，最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。2.10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。3.10过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml溶解后，4保存，保存时间为1周。4.1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。5. 0.05Tween20（sigma ）Tween20 20ml蒸馏水至 100ml混匀后4保存。6. 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81mlNaCl 17g 加蒸馏水至2000ml7. 30%丙烯酰胺（500ml） 丙烯酰胺 145g甲叉双丙烯酰胺 5g 加入到含有500ml双蒸水的玻璃烧杯中，37度搅拌融化后，放在四度避光保存。8.还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L TrisHCl pH6.8，0.5% 2-ME，10 SDS，0.5溴酚蓝，50甘油）(100ml)0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 50ml2-ME 0.5mlSDS 10g溴酚蓝 0.5g甘油 50ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。9.电泳液缓冲液Tris（MW121.14） 3.03g甘氨酸（MW75.07） 184.4gSDS 1g双蒸水至 1000ml（溶解后室温保存，次溶液可重复使用多次）10.转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）