高温胁迫下外源褪黑素对黄瓜幼苗活性氧代谢的影响.doc

应用生态学报2010年 5月第 21卷第 5期Chinese Journal of App lied Ecology, M ay 2010, 21 ( 5) : 1295 - 1300高温胁迫下外源褪黑素对黄瓜幼苗活性氧代谢的影响徐向东孙艳孙波张坚郭晓芹(西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨凌 712100)摘要以黄瓜品种津春 4号试材 ,用叶面喷施的方法 ,研究了高温胁迫条件下外源褪黑素 (m elatonin,M T)对黄瓜幼苗活性氧 ( ROS)代谢的影响.结果表明 :外源 M T能显著降低高-( relative electric conductivity, REC)及丙二醛 (MDA )含量 ,增强黄瓜幼苗叶片中超氧化物歧化酶 ( SOD )、氧化氢酶 ( CAT)、过氧化物酶 ( POD )活性 ,提高抗坏血酸 ( A sA )、谷胱甘肽( GSH )及可溶性蛋白质含量.说明 M T预处理能抑制高温胁迫条件下黄瓜幼苗体内 ROS的产生 ,提高抗氧化酶系的活性及抗氧化物质的含量 ,降低膜质过氧化水平 ,保护脂膜的完整性 ,减少电解质的外渗 ,减轻高温胁迫对幼苗造成的伤害 ,提高幼苗抗高温胁迫的能力.关键词褪黑素黄瓜高温胁迫活性氧代谢文章编号1001 - 9332 ( 2010) 05 - 1295 - 06中图分类号Q948. 1; R961文献标识码AEffects of exogenous m ela ton in on active oxygen m etabolism of cucum ber seedlings underJ. A ppl. Ecol. , 2010, 21 ( 5) : 1295 - 1300.ied the effects of foliar app lication of exogenous m elatonin (M T) on the active oxygen metabolism ofthe seedlings under high temperature stress. Under the stress, the exogenousM T could significantly-crease the activities of superoxide radical ( SOD ) , peroxidase ( POD ) , and catalase ( CAT) , andthe contents of ascorbic acid (A sA ) , glutathione ( GSH ) , and soluble p roteins, illustrating thatoxidative enzyme activities and antioxidant contents, and decrease the membrane lip id peroxidationage of high temperature stress to the seedlings.tabolism.黄瓜 (Cucum is sativus)是我国消费量较大的蔬 1958年被发现存在于牛松果体中 ,之后的大量研究菜之一 ,它起源于热带 ,生长发育过程中喜温 ,但不发现 M T具有很强的抗自由基作用 ,能减少OH和耐高温 ,越夏生产比较困难.在南方露地栽培及北方过氧阴离子含量 ,提高动物体内抗氧化酶 mRNA和1 - 3植株正常生长的环境因子.褪黑素 (melatonin, M T,研究证实 ,M T对动物和人体具有明显的延缓衰老作用 ,能减缓生物钟紊乱、改善睡眠障碍、治疗神经34特别是一些药用植物和食用植物的花和种子中含量33 3温胁迫下黄瓜叶片超氧阴离子自由基 (O2 )产生速率、过氧化氢 ( H2 O2 )含量、解质漏渗率电h pera stress. Xiang dong, Yan, SUN ZHANG ian, GUO Xiao2qinCollege Horticu N orthw & niversity, Yang 712100 hannx )Abstract: Taking the seedlings of cucumber cultivarJ inchun 4as test material, this paper stud2decrease the leaf superoxide radical (O2 ) p roduction rate, hydrogen peroxide ( H2 O2 ) content,cell mem brane permeability ( electrolyte leakage ) , and malonaldehyde (MDA ) content, but in2p retreatm ent w ith M T could inhibit the reactive oxygen species ( ROS) p roduction, raise the anti2and electrolyte leakage to p rotect the integrity of lip id membranes, being able to alleviate the dam2Key words: m elatonin; cucum ber (Cucum is sativus) ; high temperature stress; active oxygen me2抗氧化剂的含量 ,增加抗氧化酶的表达.现已夏秋茬露地和设施栽培中 ,高温往往成为影响黄瓜N2乙酰基 252甲氧基色胺 ) ,是色氨酸的吲哚衍生物 ,衰弱、增强免疫力等,现已被广泛应用于药 (保3国家大学生创新性实验计划项目 ( G200707)资助.健 )品中. 1993年发现高等植物中也存在褪黑素,3 3通讯作者. E2mail: sunyanma64 sina. com2009209221收稿 , 2010203206接受 .为过1296应用生态学报21卷相对较高 1 - 2, 5 - 7 .虽然 M T在植物体中的研究少于含量用林植芳等 11 的方法测定. SOD活性用 NB T动物及人体 ,但仍然取得了一些研究成果.研究表明 ,M T可调节植物形态建成 ,促进金丝桃愈伤组织光还原法测定 , POD活性用愈创木酚法测定 , CAT活性用紫外吸收法测定 ,MDA含量用硫代巴比妥酸根的发育8;还能调节羽扇豆的生长 ,作用类似于法测定 ,可溶性蛋白质含量参照高俊凤等 12 的方法吲哚乙酸 ( IAA ) 8 . Tan等 1 发现 ,把芦荟从 259报道 ,西红柿在成熟过程中 ,呼吸作用加强 ,过氧化物及自由基含量升高 ,并伴随着 M T表达水平的明显提高.低温条件下芦荟和西红柿成熟过程中对M T的反应均与自由基的产生及清除有关 ,而 M T在植物抗氧化代谢中的作用还缺乏系统研究.本试验以黄瓜幼苗为试材 ,采用叶片喷布外源 M T的方法 ,测定了高温胁迫前后叶片中的自由基产生速率及保护酶活性的变化等相关指标 ,以期探讨 M T在植物抗氧化代谢中的作用 ,揭示 M T在植物抵御高温逆境方面的生理作用机制 ,为 M T的外用提供理论依据和参考.1材料与方法试验于 2008年 810月在西北农林科技大学园艺学院进行.供试黄瓜品种为津春 4号,催芽后播种在装有蔬菜专用基质 (购于西北农林科技大学新天地设施农业开发有限公司 )的营养钵 ( 10 cm10 cm )中 ,萌发后置于 RXZ智能型人工气候箱(宁波江南仪器厂制造 )中培养 ,培养条件为 :光周期 14 h (昼 ) /10 h (夜 )、夜温度 ( 28 ) / ( 17- 2 - 170% ,待子叶展平后隔天用 1 /2 Hoagland营养液浇灌 ,每钵用量为 20 m l.通过前期预备试验 ,筛选并确定出效果比较明显的 M T浓度梯度 ,当黄瓜幼苗长到三叶一心时 ,选择整齐一致的壮苗用 0 ( CK)、25、50、100、150mol- 1次 ,以叶片滴水为度 ,共喷 3次.每个处理 40钵 ,每钵种植 1株.最后一次喷施 M T后 2 d,将幼苗置于相对湿度 75%、度为 ( 40 )的光照培养箱中进行高温胁迫处理.处理 0、3、6、9、12和 24 h时采集第 2和第 3片叶 ,一部分样品测定相对电导率 ,另一部分样品则用液氮速冻 ,保存在超低温冰箱 ( -70)中 ,用于测定各生理指标.-膜相对透性 = (叶片煮沸前外渗液电导值 /叶片煮沸后外渗液电导值 )100%.还原型抗坏血酸(A sA )和还原型谷胱甘肽 ( GSH )含量用 M a和 13 平均值作为各处理的实测值.所得数据采用 Excel和 SAS / W in (V8 )统计软件进行单因素方差分析和相关分析 ,并用邓肯氏新复极差法 (Duncans new m ultip le range test)进行2结果与分析-生速率和 H2 O2含量的影响从图 1可以看出 ,在黄瓜幼苗经历高温胁迫的-H2 O2含量的影响-and H2 O2 content in leaves of cucumber seedlings under highletters in the same tim e meant significant difference among treatm ents at0105 level.下同 The same below.条件下移到 4时 ,体内 M T含量增加 ;张贵友等111供试材料及幼苗培养1)、照强度 100molm光 s、相对湿度112试验设计L外源 M T于 19: 00喷布黄瓜叶片 ,隔 2 d喷 1113测定项目与方法O2产生速率用李忠光等 10 的方法测定. H2 O2测定.细胞膜透性用 DDS2307型电导仪测定 ,细胞的方法测定.上述指标均重复测定 3次 ,以Cheng114数据处理差异显著性检验.采用 SigmaPlot 1010软件作图.211高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片 O2产不同时间内 ,不同浓度 M T对 O2产生速率的影响均表现出了相同的趋势 ,即 O2产生速率随 M T浓度的增加而显著 ( P 0105 )降低 ,当浓度达到图 1高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片 O2产生速率和F ig. 1 Effects of exogenous melatonin on O2 p roduction ratetemperature同stress字母表示处理间差异显著 ( P 0105 ) D ifferent昼 / 1温 15期徐向东等 :高温胁迫下外源褪黑素对黄瓜幼苗活性氧代谢的影响1297-大 ,到 12 h时达到最大值 ,当胁迫时间延长至 24 h时 ,其又有所降低但降幅较小.表明经历高温胁迫12 h后 ,黄瓜幼苗产生了一定的耐受性.-生速率相似的趋势 ,但使 H2 O2含量达到最小的 M T- 1一直呈增加趋势.量和相对电导率 ( REC)的影响由图 2可知 ,经 M T预处理的黄瓜幼苗叶片-处理的浓度范围内 ,MDA含量随 M T浓度的增大而- 1降到最低. REC的变化趋势与 MDA含量的变化相同 ,但使 REC达到最小值的 M T浓度为 100mol- 1大 ,但还是显著低于对照.这表明经 M T预处理的黄瓜幼苗在高温胁迫后 ,膜脂过氧化水平降低 ,膜脂过氧化产物 MDA的累积量减少 ,对膜的伤害减轻 ,电解质的渗漏率减少 .相关分析发现 , H2 O2含量与图 2高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片 MDA含量和相对电导率的影响ative electric conductivity in leaves of cucumber seedlings underhigh temperature stress.,而 MDA含量与 REC之间也即 MDA含量随 H2 O2含量的增加而增加 ,而 REC随MDA含量的增加而增大.POD和 CAT活性的影响高温胁迫条件下 SOD和 POD活性明显降低 ,在 12 h达到最小值 ,之后随着胁迫时间的延长逐渐升高 ,呈“V”型变化趋势.在各胁迫时间段 , M T对SOD和 POD活性均表现出加性效应 ,即 :随着 M T浓度的逐渐增大 , SOD和 POD活性均显著 ( P - 1POD活性达到最大值.在高温胁迫 12 h时 , 50mol- 1照.外源 M T对 CAT活性的影响表现出与 SOD和POD相似的趋势 ,但使 CAT活性达到最高值的 M T- 1活性一直呈下降趋势 (图 3) .- 1显著提高高温胁迫条件下黄瓜幼苗叶片中 SOD、-酶类 , POD和 CAT则是清除 H2 O2的酶类 ,而 CAT-外源 M T对高温胁迫下黄瓜幼苗体内活性氧自由基及 H2 O2的清除发挥着重要作用.GSH含量的影响A sA和 GSH是植物体内 2种重要的抗氧化物质 ,它们对维持植物体内自由基平衡发挥着重要作用.由图 4可知 ,高温胁迫条件下黄瓜幼苗叶片 A sA和 GSH含量随胁迫时间的延长均呈下降趋势 ,这可能与活性氧自由基 ( ROS)的过量产生有关.外施M T的黄瓜幼苗 A sA和 GSH含量始终显著 ( P - 1最好.对比图 4和图 1发现 ,高温胁迫期间 A sA和GSH含量的变化趋势与 H2 O2正好相反 .相关分析50molL时 , O2产生速率降到最低.高温胁迫- 13、6、9、12和 24 h后 , 50molL- 1M T使 O2产生速率分别比之后照减小 14T8%度30%、31增2%、2717%生速率虽有增加但还是显著 ( P 0105 )低于对照.这表明 25150molLM T可有效抑制 O2产- 1生速率.随着胁迫时间的延长 , O2产生速率逐渐增外源 M T对 H2 O2含量的影响表现出与 O2产浓度为 100molL,并随时间的延长 , H2 O2含量212高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片 MDA含MDA含量的变化趋势与 O2产生速率相同.在 M T显著 ( P 0105)降低 ,当浓度达到 50molL时 ,L .两者达到最小值后又随 M T浓度的增大而增F ig. 2Effects of exogenous melatonin on MDA content and rel2MDA含量之间呈极显著 ( P 0101 )的正相关关系 ,相关系数 r = 019973 3呈显著 ( P 0105 )的正相关关系 ,相关系数 r =01843 ( n = 6, df = 4, r0105 = 01811, r0101 = 01917 ) ,3213高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片 SOD、0105)升高 ,当浓度达到 50molL时 SOD和LM T使 SOD和 POD活性分别比对照增加POD活性有所下0%.,但仍然显著继续增1大 ) SOD和浓度为 100molL,且在整个胁迫过程中 CAT从上述分析可知 , 25150molLM T均可POD和 CAT 3种保护酶的活性. SOD是清除 O2的是清除 H2 O2的专一酶类. SOD与 O2产生速率之间呈显著 ( P 0105 )的负相关关系 ,相关系数 r =- 01869 ; CAT与 H2 O2含量之间也呈显著 ( P 0105)的负相关关系 ,相关系数 r = - 01911 .说明3 3214高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片 A sA和0105 )高于对照 ,且以 M T浓度为 50molL效果1298应用生态学报21卷图 5高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响F ig. 5Effect of exogenous melatonin on soluble p rotein contentin leaves of cucumber seedlings under high temperature stress.延长 ,黄瓜幼苗体内积累的 H2 O2越来越多 ,氧化H2 O2所消耗的 A sA和 GSH量也随之增大 ,致使A sA和 GSH含量在整个胁迫期间逐渐降低.但在高温胁迫的各个时间段 , A sA和 GSH含量始终显著高于对照.因此 ,可以肯定 M T对高温胁迫下黄瓜幼苗体内保持高水平抗氧化物质具有重要作用.图 3高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片 SOD、POD和CAT活性的影响F ig. 3 Effect of exogenous melatonin on SOD , POD and CATactivities in leaves of cucumber seedlings under high temperaturestress.结果也表明 : A sA、GSH含量与 H2 O2之间均呈极显.表明随着高温胁迫时间的图 4高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片 A sA和 GSH含量的影响F ig. 4Effect of exogenous melatonin on A sA and GSH contentsin leaves of cucumber seedlings under high temperature stress.蛋白质含量的影响由图 5可知 ,高温胁迫后黄瓜幼苗叶片中可溶性蛋白质含量显著高于胁迫前 ,并呈先升后降的趋势.在胁迫 6 h时达到峰值 ,以后随胁迫时间的延长其含量缓慢下降.外源 M T可明显提高可溶性蛋白质含量 ,并随 M T浓度的增加可溶性蛋白质含量逐- 1最大 ,然后随 M T浓度的继续增大缓慢降低.3讨论与结论-H2 O2和OH等活性氧 ( ROS) ,但同时这些 ROS又被清除 ,使植物体内 ROS产生和清除处于动态平衡.这种平衡主要由植物体抗氧化酶系统 ( SOD、POD和 CAT等 )和抗氧化物质 (A sA和 GSH等 )调控.逆境胁迫使植物 ROS代谢平衡遭到破坏 ,导致 14 结构完整性遭到破坏 ,从而使蛋白质变性 ,核酸断 15 膜系统稳定与否的重要指标 ,其大小与植物抗逆境 16 - 18 -量和 REC大幅度升高 ,对植株的正常生长产生了严 19 的研究结果一致 ,这可能是由于高温胁迫阻断了细著 ( P 0101 )的负相关关系 ,相关系数分别为- 01952和 - 019913 3 3 3215高温胁迫下外源 M T对黄瓜幼苗叶片可溶性渐升高 ,当 M T浓度达到 50molL时 ,其值增至植物在正常生理条件下 ,体内会产生 O2、ROS大量积累,引起膜质过氧化 ,膜透性增大 ,膜裂 ,甚至细胞死亡. REC和 MDA含量通常是植物能力密切相关.本试验结果表明 ,黄瓜幼苗经高温胁迫后体内 O2产生速率、H2 O2含量、MDA含重威胁 ,这与 M algorzata和 W aldemar在羽扇豆上5期徐向东等 :高温胁迫下外源褪黑素对黄瓜幼苗活性氧代谢的影响1299胞内正常的电子传递 ,细胞内能荷降低 ,还原力提除 ROS的反应.外施 M T使黄瓜幼苗 A sA和 GSH含高 ,细胞质酸化 ,从而造成 ROS的积累 20 .外施 M T量降幅减少 ,这可能是由于 M T提高了单抗坏血酸能显著减缓活性氧的产生速率 ,降低 ROS对细胞膜还原酶 (MDHAR )、氢抗坏血酸还原酶 (DHAR )及的伤害 ,这与 Tan等 21 在高等动物体中的研究结果谷胱甘肽还原酶( GR )等的活性 ,加快了 A sA和一致.这很可能是由于 M T作为一种电子供体 ,直接与 H2 O2、自由基 (OH )等反应 ,自身被氧化为吲哚阳离子自由基 ,吲哚阳离子自由基再与细胞内 O23不但能抑制和清除高等动物体内活性氧的产生 ,而且对高等植物具有同样功能.SOD、POD和 CAT是植物体内酶促防御系统的3个重要保护酶 ,它们能有效分解体内活性氧自由 22 POD活性在高温胁迫 12 h以前逐渐下降 ,以后有所升高 ; CAT则在整个胁迫过程中一直处于下降趋 23 可能是由于不同植物对高温胁迫的抵御方式不同 ,也有可能是由于试验处理条件不同而引起的差异.-间都存在显著的负相关关系 ,说明高温后活性氧大量积累以及高温不利于此类酶的合成 ,使酶活性有所下降 ,当经历一段时间后 ,植株产生了一定的抗性 ,酶活性又有所升高.外源 M T能显著提高高温胁迫后黄瓜幼苗 SOD、POD和 CAT活性 ,增强黄瓜幼 24 的研究结果一致 ,这可能是由于 M T在黄瓜体内通过增加抗氧化酶相关基因的表达以及减少生物大分子的降解来提高抗氧化酶活性 ,从而增强了对 ROS的清除能力.A sA是一种普遍存在于植物组织的抗氧化物-ROS反应. GSH是胞内代谢过程和植物遭受氧化胁迫时产生的过氧化物的有效清除剂之一 ,它可增强植物对环境胁迫的抵抗能力 ,机体内的氧化型谷胱甘肽 ( GSSG)和还原型谷胱甘肽 ( GSH )可以相互转化 ,当植株遭遇逆境胁迫时 , A sA和 GSH含量将会 25 23 的研究结果一致. A sA含量下降说明在高温胁迫下部分 A sA被氧化成氧化型抗坏血酸 (DHA ) ;而 GSH含量下降很可能是由于 GSH作为谷胱甘肽氧化酶( GPX)或者谷胱甘肽转移酶 ( GST)的底物参与了清GSH的再生 ,从而保证了高温胁迫下黄瓜体内相对较高浓度的 A sA和 GSH ,增强了植株对热胁迫的抵御能力.高温逆境直接引起植物体内蛋白质的变性和凝聚 ,从而使植物体遭受伤害.在高温胁迫下 ,构成蛋白质的多肽链被打断 ,蛋白质空间结构遭受破坏 ,蛋 26 温条件下启动热激蛋白 ,可溶性蛋白含量增加 ,其合 27 施 M T植株在高温胁迫过程中可溶性蛋白质含量明显高于未喷施 M T植株 ,原因可能是由于高温胁迫下 M T能促进黄瓜植株合成更多的热激蛋白 ,产生的热激蛋白可保护机体蛋白质免遭损伤或修复已受 28 综上 ,M T不仅在动物和人体内起着重要的抗 22 -黄瓜保护酶活性 ,有效清除体内 ROS,抑制细胞膜透性和 MDA含量的增大 ,提高黄瓜叶片内抗氧化剂和可溶性蛋白质含量 ,提高黄瓜对高温逆境的抵- 1- 1参考文献 1 Tan DX, M anchester LC, Reiter RJ, et al. Significanceof melatonin in antioxidative defense system: Reactionsand p roducts. B iological S ignals and Receptors, 2000,9: 137 - 1592 Reiter RJ, Tan DX, Burkhardt S, et al M elatonin inp lants. N utrition Review s, 2001, 59: 286 - 290gress on melatonin. Foreign M edical Sciences ( Section ofPharmacy) (国外医学药学分册 ) , 2004, 31 ( 4 ) :212 - 216 ( in Chinese)丽芳 ) . Recent research p rogress in pharmaceutical andphysiological effects of melatonin. 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