蓝莓多酚的提取及检测.doc

蓝莓多酚的提取及功能性研究进展 蓝莓(Blueberry)属杜鹃花科越橘属，多年生落叶或常绿灌木，果实呈深蓝色，披白霜，近圆形，果肉细腻，果昧酸甜，营养丰富。蓝莓的种植历史相对较短，美国是最早栽培蓝莓的国家，距今也仅有100多年的历史。20世纪50年代我国东北出产的野生笃斯越桔开始用于造酒，80年代我国开始引进国外品种，目前蓝莓在我国已得到广泛种植。 1981年，Haslam首次提出植物多酚这一术语，它将多酚分为单宁及其相关化合物（如单宁的前体化合物和聚合化合物）和聚黄烷醇类（含缩合单宁和相关化合物）两大基本类型多酚是植物体内复杂的酚类次生代谢产物，具有多元酚结构，主要存在于植物的皮、根、叶、壳及果肉中。有关多酚的分类方法有很多种，类黄酮、花青素、酚酸等都属于多酚。近几年，国外学者根据多酚结合方式和萃取方法的不同，将其分为可萃取多酚(extractable polyphenols)和不可萃取多酚(non-extractable polyphenols)，所谓可萃取多酚主要是指通过简单的有机溶剂萃取或水就可以获得的处于游离状态的多酚，不可萃取多酚主要是指结合于细胞壁上的一些水合单宁酸和原花青素，需通过化学或者酶处理方法，打破多酚物质与细胞壁结合的化学键，才将其分离出来的部分，目前，我们通常研究的多酚实际上是指可萃取多酚，而没有考虑不可萃取部分。此外，多酚受组成复杂、聚合度不同及原料结构性质差异等因素影响，至今尚无一种方法能适用于所有多酚的分离。1蓝莓中多酚的萃取 1977年英国学者Colin FTimberlake开始研究水果中的多酚，发现越橘属植物中含有花青素、芍药素、花翠素、牵牛色素、锦葵色素等多酚类物质。1988年中科院南京植物研究所引种兔眼蓝浆果，并对其中的花青素、花色苷等多酚成分进行检测。1996年加拿大研究中心采用聚乙烯萃取法，研究发现低丛蓝莓中花青素类的含量为6.08 mg/g- 10.22 mg/g。刘文旭、黄午阳等使用80%乙醇对蓝莓进行多酚萃取，28震荡24 h后，以没食子酸为标物，获得蓝莓全果中总酚含量为(9.44+0.22) rag/100 9 DW。Matsuo等使用甲醇作为初步溶剂萃取蓝莓叶冻干粉中的多酚，提取3次后过滤，然后使用70%丙酮进行进一步的萃取过滤，最终测得冻干的蓝莓叶中多酚的含量为11.3 %。 随着科技的进步，人们开始使用更先进的方法如酶法提取、超声辅助萃取法、微波辅助萃取法、减压萃取法等萃取蓝莓多酚，这使多酚的萃取率得到明显提高。李颖畅等使用酶法提取蓝莓果中的花色苷，结果表明：在纤维素酶用量为5 mg/g，料液比为1：8(g/mI)， pH为5.0，提取时间60 min，酶解温度45 0C的条件下，提取2次，花色苷萃取率可达350 rag/100 9 FWll叫。赵尔丰等以蓝莓果渣为原料，采用酶一超声波辅助提取法提取果渣中的花青素，在纤维素酶用量为5 mg/g，温度50，料液比1:10的条件下，采用超声震荡条件，提取功率为200W，时间20 min，然后补充加入40%乙醇，超声波强化提取10 min，所得蓝莓果渣中花青素的提取率为4.12 %，解利利等使用微波辅助萃取法，将蓝莓冻果进行整果破碎后，加入无水乙醇用微波提取法提取多酚，干燥后测得单宁的质量分数为0.29%，总单体花色苷为1.54%，黄酮为0.22%。冯进等采用减压萃取法对蓝莓叶中的多酚进行萃取条件优化，最终得出最佳提取条件为：在真空度-0.07 MPa，乙醇浓度60%，pH3.5，料液比1:50，物料粒度80目100目的条件下，提取60 min，多酚提取率为81.47%，多酚纯度为45.32%，其中多酚纯度比常压提取高6.57 %。由于原料及萃取工艺的不同，蓝莓多酚的萃取率差别较大，因此选择合适的萃取工艺显得尤为重要。 上述方法萃取的多酚（花青素）均指的是可萃取部分，早在20世纪70年代，不可萃取原花青素就在豆科植物中被发现，但由于当时缺乏先进的分析及检测手段而未受到重视，直至上世纪90年代国外科学家才开始对蔬果中的不可萃取多酚进行深入研究。1996年爱尔兰科学家Sara Matthews等提出植物中存在可萃取花青素和不可萃取花青素，他用树皮作为研究对象从甲醇萃取后的渣中使用硫解法和凝胶色谱法萃取并测定不可萃取花青素，得到的结论是有近97%的树皮中含有不可萃取花青素。，西班牙学者Sara Arranz指出不可萃取多酚主要是指存在于膳食纤维和蛋白质中的可水解单宁和原花青素L31。2007年Fulgencio Saura- Calixto等人先使用甲醇和丙酮萃取蔬果中的可萃取多酚，然后使用5 ml/L的HCl-丁醇溶液，1000C水浴3h，萃取结合原花青素(Condensed tannins)，又用甲醇硫酸0：l溶液萃取可水解单宁(Hydrolysable polyphe- n01），最终获得不可萃取多酚溶液。直到201 1年国内才开始有人关注井研究不可萃取多酚，程安玮等使用甲醇/H2S04萃取液，800C加热20h，冷却后4000 r/min，离心5 min，测得蓝莓叶中不可萃取多酚的含量为(44.930.38) mg/g。、研究证明果蔬原料中的不可萃取多酚的含量远远高于可萃取多酚的含量，这些成分可被人体结肠中细菌发酵，产生的代谢产物对人体十分有益。2多酚的分离纯化 通过简单的溶剂萃取、超声辅助萃取法等只能获得多酚粗液，要想得到纯度较高的多酚，就需要对获得的粗提液进一步分离纯化。目前最常用的纯化方法有吸附分离法、柱层析分离法和色谱分离法等。 2006年邹阳等以蓝莓色素粗提液为原料，使用 AB-8大子L吸附树脂对蓝莓花色苷精制工艺进行研究。结果表明：在树脂吸附流速为10 mL/min，解吸流速为5 mL/min时，用pH为2的80%的乙醇溶液解吸效果最佳，饱和吸附量为39.098 mg/mL，精制色素色价可达175，是国标的40多倍。李知敏采用聚酰胺树脂对蓝莓中的花色苷进行纯化，使用50%的乙醇进行洗脱，结果得到花色苷的纯度为46.35%，色价为2047，远远高于国际上规定的花色苷类物质医药用品原料含量大干20%的标准1171。2011年吕业春等先用70%的乙醇，50超声辅助萃取30 min，然后使用XAD-7大子L树脂纯化蓝莓多酚萃取液，除去糖分和蛋白等物质，测得大兴安岭野生蓝莓的总酚含量为(573.9+6.9) rag/100 9，总花色苷含量为(156.1+9.1) rag/100 9，占总酚的27.2 %。3蓝莓中多酚的组成 由于多酚成分复杂，主要受采摘季节、品种、栽培条件等多因素的影响，因此蓝莓中多酚的组成和含量不稳定。目前，已有明确的研究证明蓝莓中含有儿茶素、茄红素、碧萝芷、白藜芦醇（反转酉）等，还有一些酚酸类黄酮等的研究则不是很明确。Matsuo等经研究指出蓝莓叶中多酚的主要成分为低聚花青素，另外还含有绿原酸、槲皮素糖苷、黄酮苷、黄烷一三醇、儿茶素等。通过查阅大量文献可总结得出蓝莓果中主要含有的多酚为花青素、原花青素、花色苷、绿原酸、没食子酸、黄酮醇苷等，野生种中还含有黄色槲皮苦素、杨梅酮等物质。4蓝莓多酚的功能性研究 蓝莓最早产于美国，早在上个世纪初，国外便开始进行选种人工培养，到20世纪六七十年代，国外科学家开始研究蓝莓中的营养成分。1976年法国学者研究发现蓝莓中含有氨基酸、花青素、黄烷醇等物质。从20世纪末科研工作者开始关注并研究蓝莓中的天然活性成分（多酚），研究表明蓝莓多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种活性。研究表明，多酚分子结构中具有活泼的羟基氢，能终止自由基的连锁反应，捕获过量的自由基，因此是一类理想的天然抗氧化剂。4.1抗氧化活性 20世纪80年代以来，国内外对多酚生物活性作用作了大量研究，揭示了其抗氧化作用机理。抗氧化剂的作用机理可分为两大类型，即阻滞型和链断型。前者降低链反应速率，而后者则通过俘获链反应的自由基R和R00来干扰链的增殖。 2001年美国农业部对40种果蔬进行抗氧化对比试验，发现蓝莓是抗氧化能力最好的水果之一。法国笛卡尔大学药学院研究表明蓝莓是一种强力抗氧化剂，可以防止或限制由氧化应激所引起的眼部病变。，2002年加拿大学者Colin DKay和Bruce JHolub对矮丛野生蓝莓进行餐后血清抗氧化人体试验。，选择了8位健康的成年男性，让他们每天餐后服用100 9野生蓝莓冻干粉，结果表明人体血液中的血清抗氧化能力明显增强，血脂也有所下降。2004年美国学者Steven RMcAnulty等让9名受试者在高温条件下跑步，一组摄入蓝莓多酚，另一组摄入Vc，结果表明蓝莓多酚更适合高温条件下训练的运动员服用1221，这主要是由多酚的抗氧化性所介导的。，2008年希腊学者Magdalin APapandreou等利用小鼠的大脑细胞对野生蓝莓多酚的抗氧化性及抑制乙酰胆碱酶的活性进行研究，通过腹腔注射蓝莓多酚溶液，7d后测定小鼠的学习和记忆能力得到明显改善，抗氧化能力增强，抗坏血酸浓度升高，还原性谷光氨肽含量增多。 我国对蓝莓的研究开始较晚，早期主要集中在蓝莓种植栽培方面，近几年开始关注蓝莓的功能性研究。2004年，卢艳华等对蓝莓的两个品种欧洲越桔和笃斯越桔的标准植物提取物（原花色苷25%）进行清除自由基和体外抗氧化活性比较，发现笃斯越桔清除02自由基、DPPH自由基的能力及抗小鼠微粒体膜脂氧化的能力优于欧洲越桔_24J。解利利等研究表明蓝莓冻果的多酚粗提物具有很强的清除过氧化氢、羟基自由基和亚硝酸盐的能力，且还原能力及清除超氧阴离子能力可达到Vc水平。4.2抗肿瘤活性 研究表明，蓝莓多酚具有明显的抗癌活性，能够抑制使癌细胞增殖的酶的活性。2005年美国乔治亚大学的Weiguang Yi等以肝癌细胞(HepG2)为模型对蓝莓多酚的抗癌作用进行研究，结果表明在含量为12 mg/mL的蓝莓多酚溶液中培养人体肝癌细胞，50%的癌细胞生长受到抑制。4.3其他活性 蓝莓多酚除了具有上述功能外，近年来研究还发现蓝莓多酚的许多其他功能，例如：蓝莓多酚具有分解脂肪细胞及抑制脂肪细胞生成的作用，2011年英国每日邮报报道：美国德克萨斯女子大学研究人员利用实验鼠脂肪组织进行实验发现，取自蓝莓的多酚类物质对脂肪具有分解作用。多项测试研究结果显示，大量摄入多酚类物质可以使脂肪细胞减少73%，小剂量摄入也可以使脂肪细胞削减27%。 另外，蓝莓在欧洲被称为口服的皮肤化妆品，可防止皮肤皱纹的提早生成，更能补充营养及美白皮肤，提高皮肤弹性，其原因就是蓝莓多酚中的花青素对皮肤具有双重作用：其一它可以促进胶原蛋白形成适度交联；其二它作为一种有效的自由基清除剂，可预防皮肤发生“过度交联”，从而阻止皮肤上皱纹和囊泡的出现，花青素还可以阻止硬性蛋白酶的产生并抑制其活性，阻止自由基或弹性蛋白酶降解硬性蛋白，从内部明显改善皮肤的健康状况。 目前我国也有不少学者正在从事蓝莓功能性研究，吕业春等通过建立体外肝细胞脂肪累积模型，评价蓝莓多酚具有清除肝细胞脂肪累积的能力，揭示了蓝莓对脂肪肝的潜在预防作用。他们用油酸（0诱导 HepG2细胞脂肪累积并建立模型，分别从噻唑兰染色吸光度(MTT)值、甘油三酯(TG)值、细胞内脂滴形态三个方面评价蓝莓多酚的作用，结果表明，蓝莓多酚能显著降低1.0 mmol/LOA诱导的肝细胞脂肪累积，其中100 g/mL蓝莓多酚对TG的清除率达到40%。5结语 多酚类化合物是一类活性较强的