免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法.doc

免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。实验步骤：1. 处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。一般3106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。2. 配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。注意抑制剂的要现加现用。3. 收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。4. 超声：强度37，5秒4次（程序07）。目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。5. 离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。6. Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1PBS（4度）洗两遍，5000rpm 2分钟，吸掉上清备用。7. 细胞裂解液预清洗：为去除非特异作用，细胞裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗。转移步骤5离心好的细胞裂解液上清至步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中，4度翻转1小时。8. 抗体和Agrose-proteinA/G预孵育：为减少游离抗体消耗抗原造成IP效率下降，将抗体和Agrose-proteinA/G进行预孵育。在步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中加入200ul含0.1%BSA 的IP 裂解液及相应量的抗体，4度翻转1小时。不同抗体时间可能有不同。9. 抗原抗体孵育：步骤7和8后进行离心（5000rpm 2分钟），将预清洗好的细胞裂解液转移到含预孵育好的抗体和Agrose-proteinA/G 的EP管中，4度孵育过夜。10. 洗IP复合物：步骤9后离心（5000rpm 2分钟），吸掉上清，加入IP裂解液（一般不用加抑制剂）500 ul，弹匀后4度摇转5分钟，重复6次。最后一次离心后加入3SDS 60ul。11. WB检测。附注：IP lysis bufferTris 50 m M PH 7.4 NaCl: 150m M EGTA 2m M EDTA 1 m M Triton X-100 1%磷酸酶抑制剂：Pyrophosphate 2.5m M Glycerol phosphate 1m M Na3VO4 1m M蛋白酶抑制剂：PMSF 1m M Leupeptin 1ug/ml Aprotinin 5ug/mlIP lysis bufferReagentFinal concentrationQuantityTris-base (FW 121.1)50mM0.6055gNaCl (FW 58.44)150mM0.8766gEDTA(0.5M)1mM0.2mlTriton1%1mlHCl (FW 36.46)adjust to pH7.4ddH2OMak