APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化.pdf

L 生 E rI I N 技 B I O 盏H N 通O L O G 讯Y V o 1 1 9一 一N o 2一 一 M ar 2 0 0 8一 丌 R S r E C H 1 6 3 文章编 号 1 0 0 9 0 0 0 2 2 0 0 8 0 2 0 1 6 3 0 4 A P O B E C 3 G蛋 白的原核表达及纯化 研究报告 隋洪帅 李林 鲍作义 李敬云 军事 医学科学院 微生物流行病研 究所 全军艾滋病检 测中心 病 原微 生物 生物安全 国家重点 实验 室 北京 1 0 0 0 7 1 裔 要 目的 原核表达 重组 A P 0 B E C 3 G蛋 白 为其功 能及 免疫原性 研究奠定 基础 方法 提 取 H 9细胞 全细胞基 因组 R N A 通过 R T P C R获得 目的基 因 经纯化 酶切 后克隆到原核表达载体 p E T 3 2 a中 转 化大肠杆菌 B L 2 1 D E 3 菌株获得表 达工程菌株 并对表达条件和纯化条件进 行优 化 利用 We s t e rn B l o t 分析鉴定 目的蛋 白 结果 构建 了A P 0 B E C 3 G蛋 白的原 核表达载体 A p o H i s p E T 3 2 a 并在大肠杆 菌 中获得高表达 目的蛋 白以可溶性蛋 白形 式存在 经 N i N T A亲和层析柱 一步 纯化 获得 了高纯度 的重组 AP OB E C 3 G蛋 白 蛋白浓度可达 1 2 m g mL We s t e rn B l o t 显示获得 了 目的蛋 白 结论 在原核表 达系统 中表达 纯化 了可溶性 A P O B E C 3 G蛋 白 为进 一步对其进行免疫原性和功能研究奠定 了基础 关键词 A P O B E C 3 G蛋 白 原核表达 蛋 白纯化 溶茵酶裂解 超声破 碎 中图分类号 Q 7 8 文献标识码 A P r o k a r y o t i c E x p r e s s i o n a n d Pu r i fic a t i o n o f t h e APOBEC3 G P r o t e i n S U Ho n g S h u a i L I L i n Bo o Z u o Yi L I J i n g Yu n S t a t e Ke y l a b o r a t o r y o f P a t h o g e n a n d B i o s e c u r i t y P L A C e n t e r f o r HI V T e s t I n s t i t u t e o f Mi c r o b i o l o g y a n d E p i d e mi o l o g y A c a d e my o f Mi l i t a r y Me d i c a l S c i e n c e s B e i j i n g 1 0 0 0 7 1 C h i n a Ab s t r a c t Ob j e c t i v e T o c l o n e p r o k a r y o t i c e x p r e s s a n d p u ri f y A P O B E C 3 G p r o t e i n i n v i t r o Me t h o d s T h e g e n e f r a g me n t c o d i n g AP OB EC 3 G p r o t e i n wa s a mp l i fi e d b y R T P C R a n d i n s e r t e d i n t o p l asmi d p E T 3 2 a t o c o n s t r u c t a r e c o mb i n a n t p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r A p o Hi s p E T 3 2 a T h e v e c t o r w a s t r a n s f o r me d i n t o E c o l i B L 2 1 D E 3 T h e e x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n c o n d i t i o n W a S o p t i mi z e d Th e p u r i fi e d r e c o mb i n an t p r o t e i n wa s i d e n t i fi ed w i t l l W e s t e rn Bl o t Re s u l t s Th e re c o m b i n ant A P O B E C 3 G p r o t e i n e x p r e s s i n g v e c t o r w a s c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f o rme d i n t o E c o l i B L 2 1 D E 3 and the s o l u b l e AP OB EC 3 G p r o t e i n w a s e x p r e s s e d u n d e r i n d u c t i o n wi t l l 0 1 mmo l L I P T G for 3 h o u r s Hi g h p u ri t y n a i v e AP OB E C3 G p r o t e i n Was p u r i fied wi t l l Ni NT A a ff i n i t y c h r o ma t o g r a p h a n d the c o n c e n tr a t i o n o f p r o t e i n s wa s 1 2 mg mL W e s t e rn B l o t s h o we d t h a t the rec o mb i n a n t p r o t e i n c o u l d b e i d e n t ifie d b y s p e c i fi c a n t i b o d y Co n c l u s i o n Th e rec o mb i n an t AP OB E C3 G p r o t e i n Was s u c c e s s f u l l y e x p re s sed an d p u r i fi e d i n E c o l i Th i s l a y s f o u n d a t i o n for t h e s t u d y o f the s t r u c t u re an d f u n c t i o n s o f AP OB EC 3 G p r o t e i n i n v i t r o Ke y w o r d s A P O B E C 3 G p r o t e i n p r o k a r y o t i c e x p res s i o n p r o t e i n p u ri fi c a t i o n l y soz y me l y s i s u l tr aso n i c d i s i n t e g r a t i o n AP OB E C3 G a p o l i p o p r o t e i n B mRNA edi t i n g e n z y me c a t a l y t i c p o l y p e p t i d e l i k e 3 G 蛋 白 也被称为 C E M1 5蛋 白 是 胞 嘧啶脱氨基化酶家族成员 1 1 2 0 0 3年研究 发现 A P 0 B E C 3 G蛋 白 可以抑制人免疫缺陷病毒 H I V 的感 染 在 T细胞 中 当 H I V 一 1 进 行逆转 录合 成 c D N A时 A P O B E C 3 G 可以催化 脱氧胞 苷 d C 脱氨基 引起 D N A合 成的突变田 D N A突变会在病毒 D N A中产 生大量 的终止密码子或引起 G A突变 使其最终被宿主 D N A修 复系统切割 因此 A P 0B E C 3 G蛋 白是细胞内天然 的抗 HI V 一 1 的防御机制 但病毒也发展 了 V i f 蛋白来拮抗 A P 0B E C 3 G蛋 白 的功能嘲 随后 的研究显示 AP 0 B E C 3 G蛋 白具有广谱抗逆转 录 病毒 功能 对包 括 HI V 乙 型肝炎 病毒 HB V 和 鼠 白血病 病 毒 ML V 等在内的许多逆转录病毒都具有抵抗作 用 6 1 因此 在 体 外表达 A P OB E C 3 G蛋 白 并对其结构 和功能进行系统研究 对 于 探讨其抗病毒机制具有重要意义 我们利用 常规 的基 因工程 技 术 克隆 表达并纯 化了 A P O B E C 3 G蛋 白 为 A P O B E C 3 G蛋 白的 功能研究及抗体制备奠定了基础 1 材 料 与方 法 1 1材 料 人 T淋 巴细 胞 H9由本 室保 藏 大肠 杆菌 D H 5 和 B L 2 1 D E 3 菌株 购 白天根生 化科技 北 京 有 限公司 原 核表 达载体 p E T 3 2 a由本室保存 限 制性 内 切 核 酸 酶 S a c I H i n dm D N A Mar k e r及 O l i g o d T 购 自大连 T a K a R a公 司 T 4 D N A连接酶购 自N e w E n g l a n d B i o l a b s 公司 Hi s t a g g e d抗体 购 自 N o v a g e n公 司 HR P标记 辣根 过 氧化物酶二抗购 自中杉金桥公 司 蛋 白酶抑制剂 购 自 R o c h e 公 司 其他试剂均为分析纯产品 p MD1 8 一 T载体试剂 盒购 自T a K a R a公 司 R N A提取试 剂盒 收稿 日期 2 0 0 7 0 9 2 4 基金项 目 国家 自然科学基金项 目 3 0 4 7 1 4 9 6 作者简 介 隋洪 帅 1 9 8 0 男 硕士研究生 通讯作者 李敬 云 E 一 眦 i l l I j y 固 b I n i a c c n 维普资讯 1 6 4 L生 E S I N 技 BI O T 术 ECHN 通 OLOG 讯 Y V o 1 1 9一 一No 2一 Ma r 2 0 0 8一 Tr ER 购 自 Q i a g e n公司 质粒提取试剂盒和 D N A纯 化回收试 剂盒购 自 P r o me g a公 司 G e n e A mp P C R S y s t e m 9 7 0 0 A p p l i e d B i o s y s t e m s 公 司 超声 波仪 C O L E P a r m e r 公 司 A l l e g r a 2 1 R离心机 B E C K M A N公 司 H Z Q F 1 0 0振荡培养箱 哈尔滨 东联 电子技术开 发有限公 司 蛋 白电泳仪及半 干电转仪 B i o R a d公 司 N i N r A亲和层 析柱 G E h e a h h b i o s c i e n c e A B 1 2 目的基 因 的获 取 克 隆及 测序 通过 G e n B a n k检索获取 A P O B E C 3 G蛋 白的 m R N A序列 利 用 P r i me r 软 件设计 P C R扩 增 引物 A p o f a 5 T A G A G C T C AG G A T GAAGCC T C AC Tr CAG AAAC一 3 和 Ap o b a 5 一 T G AAGC Tr G 兀耵 C C T G A T r C T G G A G A A T G G C 一 3 并 分别 引入 S a c I和 H i n d 酶切位点 下划线部分 由上海生工生物工程公司合成 复苏培养 H 9细胞株 用 Q i a g e n公 司的 R N A提取试 剂盒提 取细胞基因组 R N A 首先逆 转录细胞基 因组 mR N A获得 c D N A 具体 反应条 件为 R N A模板 l 2 L O l i g o d T 2 t r L d N T P 4 L 7 0 孵 育 5 mi n 冰浴 2 mi n 加入 M ML V 5 x 缓 冲液 5 L M ML V逆 转录酶 l L R N a s e抑 制剂 l L 4 2 孵 育 2 h后 7 0 处理 1 5 mi n灭活逆 转录酶 加入 R N a s e A l L 3 7 处理 2 0 mi n消化 R N A P C R扩增 c D N A获得 目的基 因 反应条件为 9 4 2 m i n 9 4 o C l mi n 5 5 o C l mi n 7 2 o C 2 5 mi n 3个 预 循 环 9 4 3 0 S 5 5 3 0 S 7 2 o C 2 mi n 3 0个 循环 7 2 o C 1 0 m i n 用 l 琼脂糖凝 胶电泳鉴定扩增产物 使用 D N A纯化 回收试剂盒切胶纯化 回收 P C R扩增产物 并 与 p M D1 8 一 T载体于 l 6 进行连接 再转 化大肠杆菌 D H5 e t 感受 态细胞 挑选 阳性重组子 并进行菌落 P C R和双酶切鉴定 将 阳 性重组质粒 p M D1 8 T A P O B E C 3 G送北京诺塞基 因公司测序 l 3 表达载体的构建 分 别 以 S a c I Hi n d n l双 酶 切 克 隆 质 粒 p MD 1 8 T A P O B E C 3 G 和 表 达 载 体 p E T 3 2 a 切 胶 纯 化 回 收 双 酶 切 的 A P O B E C 3 G基 因和 p E T 3 2 a表达载体 用 T 4 D N A连接酶于 l 6 过夜 连接 将 连 接产 物转 化大 肠杆 菌 D H5 e t 菌株 通 过菌 落 PC R 双酶切鉴定筛选得到含有 目的基 因的阳性克 隆 将该 阳性 克 隆送北 京 诺赛 基 因公 司 进行 D N A序 列 测 定 测 序结 果 经 C L U s T A L X 1 8 MS W Z I P软件分析 比对 将 含正确基因序列的表 达载体命名为 A p o H i s p E T 3 2 a 1 4宿主 菌培养与 目的蛋 白表达 将 获得 的表达 载体 A p o Hi s p E T 3 2 a转化 大 肠杆 菌 B I 21 D E 3 菌株 挑取单 菌落接种到 L B液体培养 基 含 氨苄青霉素 1 0 0 g L 中 3 7 2 4 0 r mi n振荡过夜培养 次 13 晨吸取 l mL 新 鲜菌 液接种 至 1 5 0 m L L B液体 培养 基 含氨 苄青 霉素 1 0 0 L 中 3 7 o C 2 4 0 r m i n振荡培养 至对数 中期 p s 值约 0 6 用 0 1 m mo l L I 胛 G诱导 表达 3 h后离心 收集 菌体 将菌体 沉 淀用上样缓冲液溶解并 煮沸变性蛋 白后 行 S D S P A G E 观察 蛋 白表达情况 1 5 目的 蛋 白的 分 离纯 化 如上方法诱导 6 0 0 mL菌液表达 A P O B E C 3 G蛋 白 离心收 集菌体后加入 2 4 mL裂解缓 冲液 N a 3 P 0 4 5 0 m mo l L N a C I 3 0 0 m m o l L p H 8 0 重悬 用 3 0 的功率超声处理 1 0 m i n后 用溶菌 酶方法 继续处理 最后 4 C 离心取上清以获取天然蛋 白 用孔径 为 0 4 5 p m 的滤器将上述含有蛋 白的液体过滤 之后缓慢注 入 已用平 衡缓 冲 液平 衡 的含有 l mL C h e l a t i n g S e p h a r o s e的 N i N T A 亲和 层 析柱 上样 完 毕后 再 次 用平 衡 缓 冲液 和 含有 5 0 m mo l L咪唑的洗脱 缓冲液洗涤层析 柱 去 除结合 在凝胶上 的非 特异性 蛋白 之后用含有 1 5 0 m mo l L咪 唑的洗脱缓 冲液将 目的 蛋 白洗脱下来 行 1 2 的 S D S P A G E分析样品 并用紫外分光光 度计进行定量和纯度 鉴定 1 6 目的蛋 白 的鉴 定 取 8 0 L纯化后上清 与 2 0 L 5 x S D S上样缓 冲液充分混 匀 沸 水 煮 3 mi n后高 速离 心 5 m i n 取 2 0 L上样行 l 2 S D S P A G E S D S P A G E后将蛋 白通过半干电转仪转移到硝酸纤 维素膜上 用 5 脱脂奶粉封闭后 以 H i s t a g g e d抗体 为一抗 H R P标记 的羊抗 鼠 I g G为二抗 进行 We s t e rn B l o t 最后用化学 发 光于 X一 线 胶片显影 2结 果 2 1 A P O B E C 3 G蛋 白基 因的扩增 克隆和序列分析 A P O B E C 3 G蛋 白基 因 PC R产物 的 l 琼脂糖凝胶 电泳结 果 如图 l 扩增片段大小约 l 3 k b 从 p MD 1 8 一 T A P O B E C 3 G质粒 中也切 出了同样 大小的基因片段 与预期结果一致 将获得 的 p MD 1 8 一 T A P O B E C 3 G质粒进行测序 测序结果与 G e n B a n k中的 AP O B E C 3 G基 因序列完全一致 2 2表达载体的鉴定 将 p M D1 8 一 T A P O B E C 3 G质粒经 双酶切获得 的 A P O B E C 3 G 基因片段亚克隆入表达载体 p E T 3 2 a中 连接产物转化大肠杆菌 D H 5 仅感 受态细胞 随机挑取单克 隆菌落 经菌落 PC R鉴定 为阳 性 图 2 后 提取 质粒 D N A 使 用 S a c I H i n d n l 进 行双 酶切 鉴 b 0 M 2 o 0 0 1 0 0 0 7 5 o 5 0 0 2 5 o 1 0 0 2 M b p 2 O 1 0 0 0 7 5 o S 0 0 2 5 o 1 o 0 图 l P C R扩增 目的基因 M D L 2 0 0 0 l 阴性 对照 2 目的基 因 6 7 图 2 菌落 P C R鉴定 M D L 2 0 0 0 l 阳性对照 2 6 克隆 P C R扩增 7 阴性对照 维普资讯 隋洪帅等 A P O B E C 3 G蛋 白的原核表达及纯化 l 6 5 定 阳性质粒 可以切 出与 P C R产物大小一致 的 目的片段 图 3 将双酶切阳性的质粒进行 D N A序列测定 测序结果经 比对 分 析 显示获得序列完整且读框正确的表达载体 2 3 目的蛋 白的表 达与分析 将转化有质粒载 体 p E T 3 2 a和表达载体 A p o Hi s p E T 3 2 a的 大肠杆菌 B L 2 l D E 3 菌株于 3 7 培养 至对数 中期 加入不 同浓 度 的诱导剂 I P r r G进行诱导 继续培养 3 h后 离心 收集全菌 经 处理后进行 l 2 S D S P A G E分 析蛋 白表达情况 结果如 图 4 目 的蛋 白得 到高效表达 诱导剂浓度对该蛋 白表达量 影响甚微 故 选择 0 1 m mo l L的 I P r r G诱导浓度进 行诱 导表达 实验 中还发 现 延长诱导 表达时间和改 变起 始诱 导时间并不能提 高 目的蛋 白的表达浓度 结果未示 依上述方法诱导 A P O B E C 3 G融合蛋 白的表达 收集菌体沉 淀后将其重悬于裂解缓冲液中 分别使用 超声 溶 菌酶或超声外 加溶菌酶处理方法裂解菌沉淀 比较不 同处理 方法获得可溶性 蛋 白 的多少 将处 理后 的样 品离 心 收集 上清 行 l 2 S D S P AG E 结果如 图 5 可见超声破碎和溶菌酶裂解联合应用 处理菌 沉淀获得的可溶性蛋 白量最高 2 4 目的蛋 白的 分 离纯 化 如上方法诱导 A P 0 B E C 3 G蛋 白的表达 离心 收集菌体 采用 超声外加溶菌酶处理的方法获得含有可溶性 A P OB E C 3 G融合蛋 白的上清 经 N i N T A亲和层 析柱纯化后 将 蛋 白洗脱 到含 1 5 0 m mo l L咪唑的洗脱缓冲液 中 行 l 2 S D S P A G E观察 蛋 白纯 度 结果如图 6 经紫外分光光度计测定 纯化样品中的蛋 白浓度 为 1 2 m g mL 纯度较高 b D M 1 2 3 4 5 6 7 8 2 0 o 0 1 O 7 5 0 5 o 0 2 5 0 1 o 0 图 3 表达载体的双酶切鉴定 M D I 2 0 0 0 2 4 6 8 分别为克隆 P C R扩增 1 3 5 7 分别为相应克 隆提取质粒双酶切结果 M 1 2 3 4 5 6 7 图 4蛋白诱导表达分析 M 标准蛋 白 1 p E T 3 2 a 未诱导 2 p E T 3 2 a 诱导后 3 A p 0 一 H i s p E T 3 2 a 未诱导 4 7 A p 0 一 Hi s p E T 3 2 a经 I P T G诱导 I P T G浓 度分 别为 1 0 0 5 0 2 5和 0 1 mmo l L 2 5 目的蛋 白的 分 析 鉴 定 We s t e rn B l 0 t 检测 结果显示 在相对分 子质 量约 6 3 0 0 0附 近有 特异性显 色条带 出现 图 7 说 明所纯 化 的 A P O B E C 3 G融 合蛋 白能够被特异性的标签抗体所识 别 抗原性较好 2 O D 0 Io 1 4 4O O M 2 3 4 图 5 蛋 白表达超声破碎 M 标 准蛋 白 1 A p o Hi s p E T 3 2 a经 I P T G诱导表 达全菌 2 诱导 菌经超 声破 碎与溶菌酶联 合处理后上 清 3 单独超声 破碎处理 上清 4 单 独溶 菌酶裂解处理上清 M 9 4 I 0 0 6 6 2 o 0 4 5 0 0 0 35 O 2 4 O 2 O D 0 Io 1 4 4 O 0 M 1 2 3 图 6纯化后蛋 白的 S DS P AG E M 标 准蛋 白 1 3 获得的纯化蛋 白 M 1 M 1 图 7 纯化蛋 白的 S D S P A G E 左图 和 We s t e rn B l o t 右 图 M 标准蛋 白 1 纯化后 的融合蛋 白 3讨论 近年来 随着 A P O B E C 3 G蛋白抗病毒功能 的发现 国外学者 已经开展 了 A P O B E C 3 G蛋 白的表达和功能研究 但 国内尚未见 相关报道 我们在大肠杆菌中高效 表达 的可溶性 A P O B E C 3 G蛋 白 为其功能研究 奠定 了基础 一一姗 9 目 4 3 2 一 一 一 l i一彻 一 姗 9 d a 2 2 维普资讯 1 6 6 生 物 技 术 通 讯 L E TF E RS I N B I OT EC HNOL OGY V o 1 1 9 N o 2 Ma r 2 0 0 8 我们 在构建高效表达 A P O B E C 3 G蛋 白工程菌株 的基础 上 采用多种方法对蛋 白表达 条件 进行 优化 考察 了诱导剂浓度 诱 导 时机 培养温度 以及 破碎裂解 回收 纯化 蛋 白等多个 条件对 蛋 白表达 的影响 结果表明 诱导时机的选择是表达 成功与否 的 关键 因素 直接决 定天然蛋 白和包涵体形式蛋 白的 比例 当起 始 诱 导时菌液 D 值处 于 0 6 0 8时 可溶性蛋 白量 可达到最大 可 占菌体总蛋 白的 3 0 左 右 我们 采用 超声 破碎和 溶菌 酶裂解 相结 合 的方法 分离 到 了 A P O B E C 3 G天然蛋 白 经典 获取 天然 蛋 白的方法多为溶菌酶 裂 解 但在本研究 中我们试验 了多种 p H 值的裂解缓 冲液均告 失 败 而单独进行超 声处 理的裂解 效果也不理想 具体原 因尚不清 楚 也未见相关文献的报道 用超 声破碎 和溶菌酶裂解相结合 的 方法能够最大 限度地获取天然蛋 白 效 率明显高 于单独 超声破 碎或溶菌酶裂解 由于变性蛋 白的复性是一个烦琐 而又艰 巨的 过程 而且有时不能得到可溶性蛋 白 或得到 的只是没有任何生 物活性 的可溶性蛋 白 因此 直接制备可溶性蛋 白对 于研究蛋 白 功能和蛋 白质的相互作用具有 重要 意义 在用 N i N T A 亲和层 析柱 纯化 A P O B E C 3 G 融合 蛋 白时发 现 上柱前向样 品缓 冲液 中加入少量咪唑 其终浓度为 2 0 m mo l L 是消除非特异性蛋 白结合 的重要步骤 在蛋 白挂柱 后 使用 含 5 0 m mo l L咪唑的洗液 冲洗层析柱 也可 非常有效地去 除非特 异性结合蛋 白 在菌体裂解和蛋 白纯化过 程 中加入蛋 白酶抑制 剂并选 择较低 的温度 4 可以防止蛋 白的降解 防止出现过多 的蛋 白碎片 此外 在洗脱 目的蛋 白时 选择较高 的离子强度 1 5 0 mm o l L咪唑 一次快速洗 脱 洗脱 体积小 效率高 可获得 高浓度的 目的蛋白 总之 A P O B E C 3 G蛋 白的