香菇多糖的生产..林志豪.ppt

香菇多糖的生产 生物技术1111林志豪 香菇多糖简介 香菇多糖 简称LNT 存在于香菇中 分子量为100万 是一种非特异性免疫刺激剂 具有抗病毒 抗肿瘤 调节免疫功能 T细胞促进作用 现在已被广泛用于不能手术和化疗后的癌症病人的康复治疗 与其他抗肿瘤药物相比 香菇多糖几乎无任何副作用 是目前已知最强的免疫增强剂之一 到目前为止 香菇多糖仍是从香菇子实体中提取 香菇子实体生长周期长 受环境条件的影响与限制 产量低 从而导致香菇多糖的生产成本高 价格昂贵 项目原理 本实验主要采用传统的热水浸提法 中性多糖常用水作溶剂来提取 可以用水浸煮 香菇中色素较高 活性炭有脱色素 脱去异味等作用 蛋白质不溶于氯仿等有机溶剂 可对香菇多糖进行除去杂蛋白 而香菇多糖在氯仿中溶解度大于在热水中的溶解度 所以可以用氯仿对香菇多糖进行萃取 项目原理 乙醇沉淀法提取多糖时 乙醇的浓度及提取方式对多糖的得率影响较大 最有效的方法是向多糖溶液中加入乙醇 使乙醇的最终浓度依次达到40 60 70 80 离心每次沉淀 乙醇沉淀得到的不一定是纯的多糖 还需用凝胶柱色谱进行分离纯化 用苯酚 硫酸法显棕色 可以对多糖进行定性检测 香菇子实体有含量较多的脂类的物质 可以用石油醚 乙醚等低级性溶剂除去脂溶性杂质 因为香菇肉质太厚 萃取时氯仿很难渗透至其深处 则萃取物的产率低 热水提取法多糖在260nm和280nm波长处有较明显的吸收峰 项目器材与试剂 实验器材 组织捣碎机 恒温水浴锅 循环水式真空泵 冷冻离心机 凝胶柱 脱脂棉 再字夹 紫外分光光度计 容量瓶 试管 烧杯 紫外检测仪 记录仪 流量泵 试剂 氯仿 无水乙醇 丙酮 乙醚 苯酚 硫酸试剂 苯酚3g 浓硫酸5mL 溶于95mL无水乙醇中 原料 香菇 项目步骤 多糖的提取热水浸提 称取香菇10g 于组织捣碎机内粉碎 倒入烧杯中 加20倍量的水 将烧杯放入恒温水浴锅中 90 加热30min 然后用布氏漏斗和真空泵进行抽滤 取滤液 脱色 除味 在滤液中加入活性炭 1mg ml 搅拌吸附1h 抽滤 取滤液 萃取 除杂蛋白 在滤液中加入氯仿溶液 充分混合后 过滤 取滤液 重复萃取 除杂3次 乙醇沉淀 在萃取液中加入无水乙醇 使其乙醇浓度达80 沉淀12h 于冷冻离心机中 4000 min 离心30min 取沉淀脱脂 沉淀物分别用无水乙醇 丙酮 乙醚洗涤3次 即得香菇多糖提取物 多糖纯化取上述香菇多糖提取物溶于蒸馏水中 离心除去不溶物 按照项目三SephadexG50凝胶装好柱 用蒸馏水平衡48h 控制好流速 4滴 min 然后将上清液上柱分离 用蒸馏水洗脱 洗脱速度5ml min 可用恒流泵控制洗脱速度 200nm波长紫外检测 收集主要峰部分 当记录仪上出现波峰时即用试管开始收集洗脱液 冷冻干燥得白色香菇多糖 并称重 香菇多糖分析检测 定性检测 苯酚 硫酸法将苯酚 硫酸试剂喷洒在冷冻干燥好的白色香菇多糖上110 加热香菇多糖几分钟糖显棕色即为多糖 定量检测 标准曲线的制备精密称取 可用分析天平 60 干燥至恒重的甘露糖标准品0 1g 置于100ml的容量瓶中 加蒸馏水定容至刻度处 用移液管量取对照品溶液0 0 5 1 0 2 0 2 5 3 0ml 分别置50ml容量瓶中 加蒸馏水定容在各精密吸取1ml 置于带塞试管中 准确移取8 苯酚溶液1ml 快速加入浓硫酸5ml 置于水浴锅中加热15min 取出冷却至室温 橘黄色由浓度从小到大而逐渐加深 将溶液于490nm波长的分光光度计处测定吸收度 绘制标准曲线 香菇多糖检测 样品多糖的测定精密称取香