32 889-893 转909 食品安全与检测 5+12 五种致病菌流式液相芯片检测方法的建立.pdf

现代食品科技Modern Food Science and Technology2010 Vol 26 No 8 五种致病菌流式液相芯片检测方法的建立 邱杨1 肖性龙2 吴晖2 赵丽1 刘建丽1 余以刚2 1 东莞出入境检验检疫局 广东东莞 523072 2 华南理工大学轻工与食品学院 广东广州 510640 摘要 用DNAStar软件对GenBank中沙门氏菌的侵袭蛋白invA基因 单增李斯特菌的Hly基因 金黄色葡萄球菌的sa442基 因 霍乱弧菌的hlyA基因 副溶血弧菌toxR基因进行序列分析 设计针对这些基因的特异性探针和引物 并标记生物素 探针 分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与相应的PCR产物杂交反应 用液相芯片检测仪 Liquichip 200 检测荧光信号 建立沙门氏菌 单增李斯特菌 金黄色葡萄球菌 霍乱弧菌 副溶血弧菌的快速液相芯片检测方法 检测 结果显示 该方法具有较好的特异性 偶联特异性探针的微球只与相应的病菌基因的PCR产物反应 检测灵敏度达到50 100 copies mL 该方法的建立为其它致病细菌和病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验 关键词 沙门氏菌 单增李斯特菌 金黄色葡萄球菌 霍乱弧菌 副溶血弧菌 液相芯片检测技术 文章篇号 1673 9078 2010 8 889 893 Development of A Suspension Array Method for Detection of Five Pathogen QIU Yang1 XIAO Xing long2 WU Hui2 ZHAO li1 LIU Jian li1 YU Yi gang2 1 Dongguan Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People s Republic of China Dongguan 523072 China 2 College of Light Industry and Food Sciences South China University of Technology Guangzhou 510640 China Abstract InvA gene of Salmonella spp Hly gene of Listeria monocytogenes sa442 gene of Staphylococcus aureus hlyA gene of Vibrio cholerae and toxR gene of Vibrio parahaemolyticus in the GenBank were analyzed by using the software DNAStar specific gene probes of all the five bacteria labled with biotin were prepared and coupled with fluorescencecoded microspheres The probes were used for hybridization reaction to PCR products of the five bacteria and then the liquichip detection technique for detection of all these pathogenic bacteria was established by using liquichip 200 to detect fluorescence signals in the reaction system The results showed that this method displayed high specificity to PCR products of correspondent bacteria when being used for detection The sensitivity test indicated that the detecting limitation for the viruses could reach to 50 100 copies mL The rapidly high throughput liquichip detection will provide foundation and exploration for further research to detect other pathogenic bacteria and viruses with the same technique Key words Salmonella Spp Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus suspension array 889 病原微生物是指具有致病性的一类微生物 它能引起人类和动物的疾病 病原微生物 种类众多 其中很多种病原微生物的危害很 大 1 如沙门氏菌 单增李斯特菌 金黄色葡 萄球菌 霍乱弧菌 副溶血弧菌等在世界各 地广泛流行 且致病力强 不但严重危害人 们的健康 而且造成巨大的经济损失 2 3 如 何快速有效地检测病原微生物成为了疾病防 控的关键 本实验选择常见的致病菌沙门氏菌 金 黄色葡萄球菌 单增李斯特菌 霍乱弧菌及 副溶血弧菌各菌种 收稿日期 2010 04 26 基金项目 广东出入境检验检疫局科技计划项目 编号 2009GDK41 作者简介 邱杨 1960 女 高级兽医师 主要从事动物及产品 动物源性食品检验检疫 通讯作者 余以刚副教授 具有种属特异性且同源性小的基因序列作为 靶基因 建立流式液相芯片检测方法对上述5 种常见的致病菌进行同时快速检测 实验成 果不仅可以为实验室研究及临床检验提供新 的思路 还能有效预防和控制相关食源性疾 病的发生 建立的流式液相芯片检测平台对 其它致病细菌和病毒的检测提供示范作用 对于公共卫生突发中毒事件 食品安全控制 海关进出口检验检疫 临床诊断有着重要 的指导意义 1 材料与方法 1 1 菌株 肠炎沙门氏菌 单核细胞增生李斯特菌 金黄色葡萄球菌 霍乱弧菌 副溶血性弧 菌 出血性大肠杆菌 蜡样芽孢杆菌 小肠 结肠炎耶尔森氏菌 普通变形杆菌 产气肠 杆菌 福氏志贺氏菌 铜绿假单胞菌 创伤 弧菌 溶藻弧菌14种致病菌 由深圳太太基 因工程有限公司提供 1 2 试剂与设备 表面羧基化的荧光编码微球 鞘液购置 于美国Luminex公司 TMAC temtrameihyl ammdnium chloride Tris SDS 10 solution 购置于美国Sigma公司 SPAE Streptavidin R phycoerythrin购于美国Prozyme公司 DNAiso Reagent 溴化乙锭购于大连宝生物公司 主 要设备包括 Luminex TM 100液态芯片仪 梯度PCR扩增仪 GAS7001 X 凝胶成像系统 1 3 引物探针的设计 表1 引物 探针与互补序列 Table 1 Complementary sequence primers and probes 菌株 基因 探针引物序列a 5 3 Tmb 片段 bp NH2 5 TTTTTTTTTTTTACCTATCTGGTTGATTTCCTG3 P52 1 探针 5 Biotin CAGGAAATCAACCAGATAGGT 3 P52 1 引物对1 5 Biotin TCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTAC 3 5 Biotin AGAACGACCCCATAAACACCA 3 58 5 57 9 99 引物对2 5 Biotin CGACCCGAATTACTGATCCTG 3 5 Biotin GCCAGACGAAAGAGTGTTGTTATTA 3 58 1 57 7 203 引物对3 5 Biotin CGACCCGAATTACTGATCCTG 3 5 Biotin GCCAGGCTATCGCCAATAA 3 58 1 57 4 301 沙门氏菌 invA 引物对4 5 Biotin TTTACGACCCGAATTACTGATCC 3 5 Biotin GAAAAACGTGCCGCGAC 3 58 1 57 3 403 NH2 5 TTTTTTTTTTTTCGCCTGCAAGTCCTAAGA3 P53 3 探针 5 Biotin TCTTAGGACTTGCAGGCG3 P53 3 引物对1 5 Biotin ACTGAAGCAAAGGATGCATCTG 3 5 Biotin CGATTGGCGTCTTAGGACTTG 3 58 1 58 5 98 引物对2 5 Biotin ACTGAAGCAAAGGATGCATCTG 3 5 Biotin ACATTTGTCACTGCATCTCCGT 3 58 1 58 2 195 引物对3 5 Biotin TGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATG 3 5 Biotin TAACCTTTTCTTGGCGGCAC 3 58 3 58 8 297 单增李斯特 菌 Hly 引物对4 5 Biotin GCAAGCATATAATATTGCGTTTCATC 3 5 Biotin TAACCTTTTCTTGGCGGCAC 3 59 0 58 8 405 NH2 5 TTTTTTTTTTTTTTGCATCGGAAACATTGT3 P51 7 探针 5 Biotin ACAATGTTTCCGATGCAA3 P51 7 引物对1 5 Biotin GTTGATAACAATGTTGTATTATCTACTGAAATC 3 5 Biotin GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT 3 57 6 57 1 101 引物对2 5 Biotin ACTAAATAAACGCTCATTCGCGA 3 5 Biotin AATGATTATAAAAATATCGTTTTGGCTG 3 58 7 58 2 196 引物对3 5 Biotin GTCGGTACACGATATTCTTCACG 3 5 Biotin ACGTATGGATAAAGAAGCTACAGTTGAT 3 57 3 58 1 303 金黄色葡萄 球菌 sa442 引物对4 5 Biotin GATCAATCTTTGTCGGTACACGATA 3 5 Biotin CATCGTTGTGTTGAAAAACTTATTCA 3 58 1 58 3 405 NH2 5 TTTTTTTTTTTT ATGCGATTGCCCAAGA 3 P52 6 探针 5 Biotin TCTTGGGCAATCGCAT 3 P52 6 引物对1 5 Biotin TGGAGCCAGTTATACGACGTTAGA 3 5 Biotin CGCTTTATTGTTCGATGCGTTA 3 58 9 58 9 102 引物对2 5 Biotin CCGGCATTCATCTGAATGATC 3 5 Biotin ACCTCTTTGCGCTCAAATTTCT 3 58 9 58 2 202 引物对3 5 Biotin ATGCCAAAATTGTGCGTATCAG 3 5 Biotin CGGGCCATCTCCACTGAC 3 58 6 58 6 301 霍乱弧菌 hlyA 引物对4 5 Biotin GATGCCAATATCTCATTGATTTATCG 3 5 Biotin GGGTATAACTTGCTCTCGCCTC 3 58 8 58 1 406 NH2 5 TTTTTTTTTTTTACAAGGCTCGACGGC3 P52 0 探针 5 Biotin GCCGTCGAGCCTTGT3 P52 0 引物对1 5 Biotin TGGCGATTACATTCGCGT 3 5 Biotin CACTCACTTCCCAGCGACC 3 57 3 57 8 101 引物对2 5 Biotin GATTACTGATAACTTGCCAGACGATAC 3 5 Biotin ACAAGCAGATAGTTATCACTCACTTCC 3 57 6 57 4 198 引物对3 5 Biotin TGAATGGCAGTCAACCATGG 3 5 Biotin GTAATTAAGCGTAGTTGCGCTTCA 3 58 9 58 7 300 副溶血弧菌 toxR 引物对4 5 Biotin CTTTTCAGTGGTTGGTTGTACTGG 3 5 Biotin ACGTCAATTCGGCGGCT 3 58 6 58 8 400 注 a 5 Biotin 表示上游引物 使用时一半标记 另一半不标记 b Tm值由primer express 3 0得出 从GenBank上分别选取沙门氏菌的侵袭蛋 白invA基因 单增李斯特菌的hly基因 金黄 色葡萄球菌的sa442基因 霍乱弧菌的hlyA基 因 副溶血弧菌toxR基因的相关基因序列 利用DNAStar软件进行排序分析 设计特异性 引物和探针 对每种致病菌各设计一条捕获 探针 Tm值为52 左右 设计与捕获探针杂交部分回文互补 的序列 5 端标记Biotin 3 端进行磷酸化封 闭 用于检测捕获探针与微珠的偶联效率 生物素Biotin的标记效率 对每种致病菌分别 设计四套引物 扩增产物分别为100 200 3 00和400 bp左右 用于考察扩增片段大小对信号强度 的影响 引物探针由上海超世生物工程有限 公司合成 标记并经过D HPLC纯化 引物和探针序列见表1 1 4 五重PCR反应体系的建立 采用DNAiso Reagent 全基因组提取试剂盒 宝生物公司 进行基 因组提取 通过分别优化引物浓度比例 建 立4个五重PCR体系 第1个体系为片段大小 为100 bp左右 第2个体系为200 bp左右 第3个体系为300 bp左右 第4个体系为400 bp左右 PCR反应完毕后 每管各取5 L PCR扩增产物进行1 琼脂糖凝胶电泳 在凝 胶成像系统下观察PCR扩增结果 1 5 探针与微球的偶联及偶联效率的验证 探针与微球的偶联参照Luminex推荐的 操作步骤进行 然后在杂交温度上用Luminex 200液态芯片仪吸取50 L 管进行检测 根据检测结果判断探针与微 球的交联情况 1 6 液相芯片检测体系的建立 取目标菌的PCR产物3 L 上游引物未标记生物素 扩增片断大小 为200 bp 加入TE 7 L和20 L的微球溶液 混和均匀后于95 变性5 min 在选定温度下孵育20 min 加入80 L荧光素 在选定温度温度下孵育20 min 于Luminex分析仪上进行读数 在空白 对照管中加入20 L微球工作液 10 L TE Buffer及80 L荧光素 杂交温度的优化 杂交反应时间在20 min条件下 根据探针的Tm值 选48 49 50 51 52 53 54 等7个温度梯度为研究对象 考察不同杂交 温度下液相芯片的检测效果 然后 采用优 化好的杂交温度 杂交反应时间在20 min条件下 根据扩增片断长度的大小 以10 0 bp 200 bp 300 bp 400 bp为研究对象 考察不同扩增片断长度下液 相芯片的检测效果 在优化好的杂交温度和 最佳的扩增片断大小的基础上 研究上游引 物标记生物素时 对检测信号的影响 最后 采用优化好的杂交温度 扩增片断长度以及 上游引物标记与否等 确立从多重PCR扩增 时开始时整个液相芯片检测体系 1 7 液相芯片检测体系重复性验证 提取各目标菌基因组DNA做多重PCR扩 增 所得到的PCR产物用于液相芯片的检测 试验 做3次重复实验 计算变异系数 1 8 液相芯片检测体系特异性验证 提取肠炎沙门氏菌 单核细胞增生李斯特 菌 金黄色葡萄球菌 霍乱弧菌 副溶血性 弧菌 出血性大肠杆菌等14种致病菌的对数 期培养物的基因组DNA作为PCR扩增模板 用多重PCR体系进行扩增 用液相芯片检测 体系进行检测 判断整个体系对非目标菌有 无检测信号 1 9 液相芯片检测体系灵敏度验证 提取沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单增李 斯特菌 霍乱弧菌与副溶血弧菌的对数期纯 培养物 初步浓度计算后用选择性共增菌培 养基系列稀释 即得到约1 105 1 104 1 1 03 500 200 100 50 25 10 cfu等不同浓度的菌悬液 每个稀释度各取100 L涂平板进行菌落计数 低浓度组内重复三 次 取平均值 同时各个稀释度取1 mL菌液提取模板DNA 用已经建立的液相芯 片检测系统进行检测 用于考察液相芯片整 个检测体系的灵敏度 2 结果与讨论 2 1 五重PCR检测体系的建立 图1 多重PCR电泳结果 Fig 1 Results of multiplex PCR electrophoresis 分别提取沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单增李斯特菌 霍乱弧菌和副溶血弧菌的基 因组约105 copies mL DNA为模板 混匀后 采用多重PCR对目的 基因进行扩增 反应程序为 95 4 min 95 10 s 55 10 s 72 40 s 40个循环 72 5 min 产物经1 琼脂糖凝胶电泳分析 结果 显示分别扩增出大小为100 bp 200 bp 300 bp及400 bp左右的目的条带 与预期扩增的片段大小 一致 经过优化 各引物加量终浓度范围在1 50 200 nM均有良好的扩增 电泳结果见图1 2 2 探针及微球的偶联效果检测 将5个目标菌的探针与相应荧光编码的微 球偶联 偶联后检测偶联的效率 结果见表2 各个偶联后荧光编码微球的MFI都在5000以 上 显示微球与探针偶联成功 表2 微球偶联效果检测 Table 2 Detection of effect of coupling microsphere with probe 编码微球3246513835 探针SaStaLmVcVp 阳性样品MFI1322 0 1245 6 896679869823 对照样品MF2 3 液相芯片检测体系的建立 2 3 1 杂交温度的优化 各个参与计数的荧光编码的微球均在100 个以上 表明用于计数的荧光编码微球数量 有效 所产生的MFI值可信 5个荧光编码微 球的空白对照MFI值均小于500 试验可进行 结果判断 试验结果表明 以200 bp为模板时 48 52 之间 荧光变动幅度都不大 显示52 度杂交良好 高于52 时 除Vp以外 其它四种菌的检测荧光下 降剧烈 52 是一个比较清晰的拐点 因此五种目标菌 的最佳杂交温度选为52 2 3 2 扩增片段长度对液相芯片检测效果的影响 各个参与计数的荧光编码的微球均在100 个以上 表明用于计数的荧光编码微球数量 有效 所产生的MFI值可信 5个荧光编码微 球的空白对照MFI值均小于500 试验可进行 结果判断 试验结果表明 5个目标菌在不同 的扩增片段的条件下 在52 最佳杂交温度下 扩增片断大于200 bp时 检测信号剧烈下降 出现拐点 片断 越长 信号越低 显示杂交效率下降 而100 200 bp的扩增片断对检测荧光变动幅度不剧烈 采用100 bp扩增片断比200 bp扩增片断有更高的荧光信号 经综合分析 得出五种目标菌的最佳扩增片断大小为100 bp 2 3 3 上游引物标记生物素对检测信号的影响 以上游引物标记或未标记生物素为唯一 区别 对各目标菌进行目标片断为100 bp左右的多重PCR扩增 在52 最佳杂交温度下 对各目标菌进行液相芯 片检测 各个参与计数的荧光编码的微球均 在100个以上 表明用于计数的荧光编码微球 数量有效 所产生的MFI值可信 5个荧光编 码微球的空白对照MFI值均小于500 试验可 进行结果判断 5个目标菌的检测结果 见表 3 上游引物也标记生物素用于液相芯片的 检测 对信号的增强有十分显著的作用 信 号增强率可达65 92 表3 上游引物标记生物素对检测信号的影响 Table 3 Effect of upper primer with biotin on detection signal MFI值 引物标记 32 Sa46 Sta51 Lm38Vc35Vp MFI上游引物标记8073 77 49 7389 59 9 2 6274 81 9 0 6065 49 1 2 7448 65 8 9 MFI上游引物不标记4611 74 32 4381 60 8 8 3757 83 6 3 3681 61 0 5 3894 84 0 9 MFI标记 MFI不标记 MFI不标记 0 750 710 670 650 92 2 3 4 五种目标菌液相芯片检测体系的确立 综合分析 确定五种目标菌液相芯片检 测体系为 扩增片断长度应短于200 bp 本实验采用100 bp 上游与下游引物均标记生物素用于后续 的检测 反应程序为95 4 min 95 10 s 55 10 s 72 40 s 40个循环 72 5 min 在后续的检测实验过程中 杂交温度定 为52 其它条件与程序均照Luminex公司提供的 相关材料进行 2 4 五种目标菌液相芯片检测体系的重复性验证 分别提取5种目标菌的基因组DNA 进行 多重PCR扩增 然后在完全相同的条件下 用所建立的液相芯片体系进行三次检测 用 以验证该方法的重复性和稳定性 计算各批 次间检测的平均荧光强度值的变异系数 结 果显示各菌检测变异系数在2 以内 表明该 方法具有良好的可重复性 2 5 三种菌的液相芯片检测体系的特异性验证 分别以14种病原菌基因组DNA为模板 进行液相芯片检测 结果 见表4 表明 对 目标菌的检测结果均为阳性 而对非目标菌 的扩增产物的检测值均为阴性 表明所建立 的方法具有很好的特异性 2 6 5 三种菌的液相芯片检测体系的灵敏性验证 液相芯片整个检测体系的灵敏度检测结果 如表5 检测沙门氏菌与霍乱弧菌的灵敏度为 50 copies mL 检测其它三个目标菌的灵敏度为1 00 copies mL 表4 液相芯片检测体系特异性验证 Table 4 Verification of specificity of suspension array method for pathogen detection 平均荧光强度值mean s d 样本 3246513835 结果 沙门氏菌7865 76 43108 6 03176 4 72219 7 23227 4 49阳性 金黄色葡萄球菌195 6 436578 62 13187 2 41194 1 98105 2 45阳性 单增利斯特菌112 3 03107 3 615961 66 43116 2 11103 1 06阳性 霍乱弧菌221 3 01136 2 07132 1 175743 54 26237 4 09阳性 副溶血弧菌143 1 68152 2 76121 3 13254 6 067176 57 89阳性 大肠杆菌268 5 47101 1 25125 2 33105 2 43116 1 99阴性 耶尔森氏菌81 1 01121 2 03289 6 65132 3 21124 2 09阴性 产气肠杆菌195 2 03108 1 0385 0 58103 1 0797 0 86阴性 变形杆菌173 1 0297 0 9595 0 87128 1 20145 1 03阴性 志贺氏菌121 1 0786 0 9699 0 7898 1 08104 0 97阴性 蜡样芽孢杆菌98 1 5485 0 8978 0 76142 1 97133 1 89阴性 铜绿假单胞菌89 2 6490 1 9893 3 0979 4 49102 2 95阴性 创伤弧菌107 1 0910