生物技术制药 重点.doc

分离纯化酶的一般程序l 粗酶液的制备：材料的选择，发酵液处理，细胞破碎及酶的抽提l 酶的初步分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，离心分离l 酶的高度纯化（酶的精制）：层析法（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析），电泳（等电聚焦电泳） l 浓缩干燥及结晶：透析，旋转蒸发，超滤，冷冻干燥粗酶液的制备1、细胞破碎（机械、物理、化学、酶解）2、酶的抽提（酸碱、盐溶液、有机溶剂）酶的主要分离技术1离心分离2沉淀分离（等电点沉淀法，盐析法，有机溶剂法）3膜分离（超滤，透析）酶的主要纯化技术层析技术离子交换层析ion exchange chromatography凝胶过滤层析gel filtration疏水层析hydrophobic chromatography亲和层析affinity chromatography区别离子 带不同电荷的蛋白质与固定相的吸附洗脱能力不同凝胶 分子大小，相对分子量疏水 蛋白的疏水集团与固定相的疏水配基吸附能力不同亲和 根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的方法凝胶层析的原理 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出； 生物传感器的概念由生物识别物质（如酶、微生物、动植物组织、抗体等）和能量转换器相结合所构成的分析仪器，可以简便快速的测定各种特异性很强的物质生物传感器的一般结构与工作原理结构:有两个部分组成1生物分子识别元件（感受器）：酶、核酸、抗体、细胞等2信号转换器（换能器）：电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、表面等离子共振器件等工作原理：待测物质经扩散作用进入生物传感器,通过分子识别发生特异的生物化学反应,产生的生化信号经换能器转换为可定量和可处理的电信号,进而可检测出该物质的浓度酶工程在医疗上的应用药用酶:消化酶类,抗炎症类,心血管类,肿瘤用酶 例淀粉酶。脂肪酶 来源麦芽微生物，消化不良食欲不振疾病诊断:酶活检测; 分析试剂固定化酶制备药物:抗生素,氨基酸改型抗体（reshaped antibody，RAb）亦叫“重构抗体”，“CDR移植抗体（CDR grafting antibody）”。 它是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定区（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改换成鼠源单抗CDR 序列。 特点：此种抗体可以使人单抗获得鼠单抗的特异性又保持人源抗体的亲和力改型抗体特点： 比嵌合抗体人源性程度高，但亲和力常常偏低。嵌合抗体（chimeric antibody） 特点:是用人抗体的C区替代鼠的C区。 效果:使鼠源性单抗的免疫原性明显减弱，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学。 属第一代人源化抗体（humanized antibody，HAb）嵌合抗体的基本原理是从分泌某种鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠IgV区基因，经基因重组与人IgC区基因按一定方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人嵌合的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达,制备特异性嵌合抗体单克隆抗体的制备基因工程抗体的制备基因工程抗体技术的基本操作是首先从杂交瘤或免疫脾细胞外周血、淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或转基因动物和植物中表达，并折叠成有功能的抗体分子，筛选出高表达细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。HAT筛选原理HAT培养基 H, Hypoxanthin次黄嘌呤; A, Aminopterin氨基喋呤 T, Thymidine胸腺嘧啶核苷由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基蝶呤阻断，瘤瘤融合细胞和未融合瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾脾融合细胞B淋巴细胞在这样的组织培养条件下不能长期生长，几天内迅速死亡。由于骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺乏株，脾细胞内却又这种酶，融合细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，并能克服氨基蝶呤的阻断，使杂交瘤细胞正常生长，大量繁殖被筛选出来。人单克隆抗体制备1EB病毒转化细胞技术2人鼠杂交瘤3人人杂交瘤4EBV转化杂交瘤技术细胞分化（differentiation）:细胞在生长发育过程中其形态、结构生理功能等方面发生某些差异变化的复杂过程，在这个过程中会呈现极性现象、细胞不均等分裂位置效应等各种现象。脱分化（dedifferentiation）: 一个已分化的细胞若要表现其全能性，形成完整植株，首先要经历脱分化过程形成分生细胞或分生细胞团，然后再经历再分化过程形成胚胎或器官发育为完整的植株。愈伤组织（callus cell）是在一定条件下，在植物的伤口或外植体的切口部位长出的蓬松的细胞团，它既是一种组织，又是一种脱分化的细胞，具有再分化能力；既可以用于次级代谢物的生产和生物转化，又可以再生成为植株。毛状根（hairy root）是植株或其组织、器官、细胞受到发根农杆菌感染后发生病理变化而形成的类似头发一样众多而细长的根组织。生长快速，易于培养，遗传上稳定且易于操作，能改变植物的次生代谢。外植体（explant）：植物的外植体是指用于遗传操作的植物的某一器官或部分，通过离体组织培养可以再生成完整的新植株，在转基因实验中用于作为外源基因转入的受体。根瘤农杆菌制备转基因植物的原理将目的基因插入到经改造的T-DNA区，借助根瘤农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA 等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中。生产用动物细胞：1原代细胞2二倍体细胞3转化细胞4基因工程细胞接触抑制：contact inhibition 细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖转基因技术的基本原理将体外构建的重组DNA分子(目的基因或基因组片段)通过显微注射、或转染胚胎干细胞等方法注入动物的受精卵或着床前的胚胎细胞,然后将此受精卵或胚胎再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带外源基因的转基因动物。基因导入技术：物理、化学和生物学方法1）显微注射法 （microinjection)2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES细胞）3) 逆转录病毒感染法4) 精子载体法 同源重组 双链DNA的两个区段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源区。同源的双链DNA可以通过相互交换进行重组。同源重组方式基因打靶gene targeting通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物体内研究此基因的功能l 基因敲除 (gene knockout): 将某个基因定向去除l 基因敲入 (gene knockin): 定向将一段基因序列替代另一段基因序列 基因打靶的必备条件l 胚胎干细胞(ES细胞) 能在体外培养，保留发育的全能性l 打靶载体 Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase) - 两个同源DNA片段（HB1,HB2），它们与ES细胞中某一非必需基因两端同源，保证转基因及标记基因neor通过同源交换定向整合在ES的这一非必需基因内部。 - 转基因（TG），必须能赋予受体ES细胞新的功能。DNA重组DNA recombination DNA重组（DNA recombination）指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。型限制性核酸内切酶：识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序，产生特异性的DNA片断。基本特性v 识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序v 切割片段的末端 对dsDNA的两条链同时切割，产生3种不同的切口： A:Isochizomers(异源同工酶)，来源不同，识别顺序相同的酶。切割位点不同，产生平头或粘性末端。 B同尾酶（isocaudarner）来源及识别序列不相同，切割后产生相同的粘性片段DNA连接酶DNA ligase 功能:是指催化两条分别具有5-磷酰基末端与3-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶 Klenow 片段： E.coli DNA 聚合酶的一个大片断。MW:7.6KDa。v 具有聚合酶I的53聚合酶活性在模版和引物存在时，以dNTP做底物，沿5-3方向合成与模版互补的DNA。v 对单链DNA有3 5外切酶活性，较弱，不适于3突出端的平滑化v 无53外切酶活性。 DNA polymerase DNA聚合酶以DNA or RNA为模板，催化DNA and RNA的体外合成。TDT Terminal Deoxynucleotidayl Transferase末端脱氧核苷酸转移酶在二价阳离子存在下，催化dNTP沿5-3方向聚合作用逐个顺序加于线性DNA分子的3OH末端。不需模版，4种dNTP任意一种可作前体物；只一种dNTP组成有一种核苷酸组成的3尾巴，同聚物尾巴用途：1给载体或cDNA加上同聚尾。2 3末端用32P标记的dNTP标记。3利用非放射性标记物生物素-11-dUTP渗入到DNA片段分子的3末端。 DNA polymerase 与TDT区别D1需要引物和模板2不能起始新的DNA连，催化dNTP连续加到双链DNA分子引物链3OH端；3不发生从引物模板上解离TDT 在二价阳离子存在下，催化dNTP沿5-3方向聚合作用逐个顺序加于线性DNA分子的3OH末端。不需模版，4种dNTP任意一种可作前体物；只一种dNTP组成有一种核苷酸组成的3尾巴，同聚物尾巴逆转录酶(reverse transcriptase)特性：1依赖于RNA的DNA聚合酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶2有效的转录RNA成为DNA3产物DNA又称cDNA,即互补DNA(Complementary DNA)4逆转录酶是一个多功能酶载体的概念（Vector）：凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因并具有传递运载外源DNA导入宿主细胞能力的DNA片段称为载体。载体应具备的条件1具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2具有合适的筛选标记3具有较高的外源DNA的载装能力4具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点5具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点克隆载体与表达载体区别共同点，复制子，选择标记，多克隆位点表达载体具备的条件:1强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。2应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。3强的终止子。4好的核糖体结合位点：SD序列、ATG 5目的基因插入位点6筛选标记7载体能够独立的复制 稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存 在于宿主细胞内。噬菌体载体 特点： 1噬菌体容量大2噬菌体转染宿主细胞的效率比大肠杆菌转化效率高2-3个数量级. 根据切除的多少，可将-DNA载体分成两大类载体：插入型载体，取代型载体Cosmid （考斯质粒，粘性质粒）Cosmid质粒是将质粒和COS粘性末端构建的克隆载体。基因组文库（genomic DNA library）： 是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片断随即的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列，包括外显子和内含子序列 。真核生物基因组文库-（cDNA文库含内含子）cDNA文库（cDNA library）建立： 从真核细胞分离总RNA,纯化出mRNA,逆转录合成互补的DNA,再在聚合酶作用下合成cDNA第二条链,然后将双链cDNA插入到载体内,构建重组体,转入宿主菌,得到的克隆总和成为该类细胞的cDNA文库.cDNA文库特征： 包含成熟mRNA的全部信息,即包含该细胞内表达的全部蛋白的编码信息. 它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被 转录成mRNA的那些基因序列。其复杂性比基因组文库低。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）1 基本原理 :根据碱基配对原则利用DNA聚合酶催化和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特性引导DNA的合成。使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。设计原则长度适宜，一般为1530个碱基；G+C含量，一般为4060；4种碱基应随机性分布； 引物自身不应存在互补序列；两个引物之间不应有多于4个碱基的互补；引物3端不应有任何修饰；引物5可以修饰。 PCR应用v 基因结构的研究：基因组制图预测序；分子杂交探针；DNA定型；PCR直接测序；利用免疫PCR检测抗原和抗体。v 基因表达与调控研究：mRNA检测；调控元件分析；蛋白质和DNA相互作用的研究。v 基因工程上构建5端内切酶接头，构建cDNA文库。v 医学上用于遗传及传染性疾病的基因诊断。v 制药中筛选抗肿瘤抗生素。v 鉴别菌株载体遗传标记检测1. 抗药性筛选法基本原理：利用载体上的遗传学标记如抗生素抗性基因,外源基因插入载体并转入受体细胞后，使受体细胞获得或缺失这些标记表型 。抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子二营养缺陷型筛选法（遗传互补法）其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。三.显色筛选法显色筛选法的基本原理：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。四.噬菌斑形成筛选法噬菌斑形成筛选： 噬菌体包装外源DNA分子后重组分子的长度为其野生型的75105时，能形成有活性的噬菌体颗粒 ，并在平板上出现清晰的噬菌斑。（三） 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因的拷贝数（拷贝数表达量）外源基因的表达效率（启动子，核糖体结合位点，SD序列ATG之间的间距，密码子的组成）表达产物的稳定性（融合蛋白，分泌表达，点突变，蛋白酶缺陷型宿主，共表达辅助因子）细胞的代谢负荷（毒性产物，影响生长平衡） 工程菌的培养条件（发酵工程） 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 包涵体优点：1表达载体构建简单2表达量高3 可表达对宿主细胞有毒或有致死作用的蛋白质4能避免细胞内蛋白水解酶的作用5有利于目的蛋白的富集和分离纯化缺点： 1要用变性剂溶解，再复性才能得到溶解性蛋白质2 处理后的蛋白质不一定能完全恢复生物学活性3处理工艺使蛋白质制备成本上升融合蛋白（fusion protein）表达的蛋白质或多肽的N末端由载体DNA编码,C末端由克隆的外源DNA编码.优点： 1 稳定2如果载体编码的是一段信号肽，则可产生分泌型表达产物3可用亲和层析纯化表达产物4用蛋白酶切获得表达产物非融合蛋白是指在大肠杆菌表达的蛋白以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，其氨基端不含原核序列.表达载体的操纵子必须改建：启动子细菌核糖体结合位点（SD序列）-真核基因起始密码子结构基因终止密码。要求SD与ATG之间距离合适。优点：较好的保持原来蛋白的活性。缺点：易被蛋白酶破坏。非融合蛋白N端有甲硫氨酸，人体用药时可能引起免疫反应。 理想发酵用菌种的要求*1、遗传性状稳定；2、生长速度快，不易污染。3、目标产物产量尽可能接近理论转化率。4、目标产物最好分泌到胞外5、尽可能减少类似物的产量6、培养基成分简单，来源广，价格廉。7、对温度、pH、离子强度等环境因素不敏感。8、对溶氧的要求低，便于培养及降低耗能。培养基配制原则（一）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确） （二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调） （三）物理化学条件适宜（条件适宜） （四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约） 发酵的一般过程 1、菌种制备 2、种子扩大培养 3、大规模罐批培养发酵液的予处理目的：改变发酵液的理化性质，加快悬浮液中固形物质沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中（多数是液相）；能够除去部分杂质（高价无机离子、杂蛋白）杂蛋白的去除： 1、加热： 65-80 使敏感蛋白质发生不可逆的变性2、调节pH：温和酸碱 提高产物的稳定性；降低发酵液粘度 3、加入絮凝剂：带正电荷高价无机离子的去除方法 离子影响树脂的交换容量。钙离子：草酸 镁离子：三聚磷酸钠铁离子：黄血盐 色素及其它物质的去除：常用脱色方法：离子交换剂、离子交换纤维、活性碳发酵过程泡沫产生的原因（1）通气搅拌的强烈程度，通气大，搅拌强烈（2）培养基配比与原料组成，营养丰富，黏度大（3）菌种、种子质量和接种量。质量差（4）灭菌质量，灭菌差起泡的危害(1)、降低生产能力(2)、引起原料浪费(3)、影响菌的呼吸(4)、引起染菌作为种子应具备的条件1、菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。2、生理状态稳定。3、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。4、无杂菌污染，保证纯种培养。5、保持稳定的生产能力。影响需氧量的因素（a)、微生物的种类和生长阶段（b）、培养基的组成：(c) .培养液中溶解氧浓度CL的影响（d）培养条件的影响：(e)二氧化碳浓度的影响引起溶解氧异常下降可能的原因（1）污染好气性杂菌