激光扫描共聚焦显微镜.doc

激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Con-focal Microscope，LSCM）是20世纪80年代发展起来的一种新型高精度显微镜。它在普通荧光显微镜的基础上加装激光扫描装置，使用可激发的荧光探针，采用敏感的光电倍增管作为检测器，利用计算机控制扫描反射镜并进行图像采集、处理和分析1。激光扫描共聚焦显微技术不仅可用于观察各种固定的细胞和组织，还可对活细胞的形态、结构和离子的变化进行实时动态观察和测定2。目前，这种技术已用于细胞形态定位、三维结构重建、细胞内离子动态变化过程等研究，并与定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段和技术相结合，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用3。激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning mi-croscopy,CLSM)是一种新型高精度的激光源加共聚焦显微镜,是利用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察分析对象进行数字图像处理的一套观察和分析系统其最大特点是对标本进行无损伤性的实时观察分析,得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号以及细胞形态的变化,对生物标本进行定性、定量、定时和定位研究,具有极大的优越性1。主要构件一个完整的CLSM系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。硬件包括表面荧光显微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制系统、显示器和图像输出打印设备,软件由三维图像分析系统和三维图像文件管理系统构成23主要功能31定性定量定位荧光分析CLSM可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位分析,还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。此外,还适用于高灵敏度的快速免疫荧光测定,可以准确检测抗原表达、荧光原位杂交斑点及细胞结合和杀伤的形态学特性并作定量分析,以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息6。32系列光学切片及三维图像重建共聚焦成像利用光源针孔与检测针孔共轭这一特性,可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自标本中非焦平面的荧光,因而具有深度识别能力及纵向分辨率,可看到较厚生物标本的细节,得到完整活的或固定的细胞及组织的系列光切片,从而得到各层面的信息,所以也被形象地称为“显微CT”。标本的各层光学切片经计算机图像处理及三维重建软件,就可得到三维立体结构,从而进行各侧面直观的形态学观察,测定细胞光学切片的物理和生物化学特性的变化,如DNA含量、RNA含量、分子扩散和胞内离子等,亦可对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析1。33Ca2+和pH等细胞内离子的实时定量测定利用Fluo-3、Fura2等荧光探针,CLSM可以测定Ca2+在活细胞内的浓度变化。CLSM可测定单个或一群细胞内的Ca2+浓度,并提供细胞内Ca2+分布的二维及至三维图像。另外,如果对细胞施加外部的刺激,CLSM就能观察到细胞内各点的Ca2+浓度在外部刺激下随时间而产生的变化6。这对于研究Ca2+等离子细胞内动力学有意义。利用SNAFL类探针可对单个或一群细胞内的pH及细胞内pH的变化进行测定。使用双荧光探针Fluo-3和CNARF可进行Ca2+和pH同时测定。34细胞膜流动性测定细胞膜荧光探针受到极化光线激发后,其发射光极性依赖于荧光分子的旋转,而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性,因此极性测量可间接反应膜的流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点、温度反应测定和物种比较等方面有重要作用7。3.5细胞的物理化学动态监测CLSM可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数进行自动测定,能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定6。3.6光活化技术生物体内许多重要的活性物质和化合物均可形成笼锁化合物,在处于笼锁状态时,其功能被封闭,而一旦被某特异波长的瞬间光照射后,光活化解笼锁,使其恢复原有活性和功能,在细胞的繁殖、分化等生物代谢过程中发挥功能。CLSM具有光活化测定功能,可控制笼锁探针分解的瞬间光波长和照射时间,从而人为控制多种生物活性产物及其他化合物发挥作用的时间和空间6。3.7细胞通讯多细胞生物体中,细胞间相互影响和控制的生物学过程称为细胞间通讯,被认为在细胞增殖和分化中起着非常重要的作用。CLSM主要从以下三方面研究胞间通讯:可从形态学上观察细胞与细胞间连接的形态变化和某些紧密连接的变化,及某些连接蛋白、黏附因子等的变化,从而阐明细胞间通讯的形态学基础;测定由细胞缝隙连接介导的分子转移;某些因子对肿瘤细胞间通讯的影响。该作用常被用于观察药物对肿瘤细胞间通讯的影响,以找出能恢复肿瘤细胞间的正常通讯,抑制肿瘤细胞无限生长的抗肿瘤药物6,9。3.8细胞分选CLSM进行细胞分选有两种方式:激光消除法,在特制的培养皿上有两类细胞,一类是未作荧光染色的细胞群,另一类是作荧光染色的细胞群,基于细胞形态及荧光特性,利用高能激光把染色的细胞群杀死,而将未染色的完整细胞亚群保留并继续培养,该方式适用于数量较多细胞的分选;Coolie-Cut-terTT法,利用高能激光于底部带膜的特制培养皿上在预选细胞四周割成八角形,而非选细胞则在该形状之外被除去,此方式适用于数量较少的突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞,即使百万分之一几率也非常理想8。3.9激光显微细胞外科技术CLSM可将激光作为“光子刀”使用,完成诸如细胞膜瞬间穿孔,线粒体、溶酶体等细胞器烧灼,染色体精确切割和神经元突起切除等一系列细胞外科手术1。3.10光陷阱技术此技术是利用激光的力学效应将一个微米级大小的细胞器或其他结构钳于激光束的焦平面,也可称为光镊,利用光镊移动细胞的微小颗粒和结构,进行细胞融合、机械刺激及细胞骨架弹性测量等,该技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。特别是在测量植物细胞的细胞骨架时很有意义,因为植物有一层厚硬的细胞壁,不能象动物细胞那样利用微操纵器对原生质膜进行机械处理1。3.11荧光漂白恢复(FRAP)技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域,造成该区域荧光分子的光淬灭,该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散,可通过低强度激光扫描探测此扩散速率59天津药学TianjinPharmacy2006年10月第18卷第5期和恢复速度。由此揭示细胞和各种变化的机制,因而可以研究细胞骨架组成、核膜结构和大分子组装等7。由于非荧光物质在未被荧光标记时不能被CLSM检测出来10,一般的生物标本均需用荧光标记物标记才能显出图像,而荧光标记物又有一定特异性,通常只能标记某一种物质,如微管、线粒体、内质网和钙离子等,故无法看到整个组织和细胞的全貌,大大限制了该仪器的使用范围。利用一些醛类固定液在固定生物组织时,选择合适的激发波长和发射波长,使蛋白质分子交连时产生具备共轭双键系统的分子,使得一些未经荧光标记的生物组织结构在CLSM下成像。由于组织和细胞各部位蛋白质的密度和结构不同,产生的荧光强度有差异,从而产生明暗反差的结构图像,这不仅使CLSM技术在运用范围大为扩展,而且大大节约了研究