鸡肉中呋喃它酮代谢物（AMOZ）残留检测方法-酶联免疫吸附试验.doc

鸡肉中呋喃它酮代谢物（AMOZ）残留检测方法-酶联免疫吸附试验第25卷第3期2009年6月阿方学院学球(自然科学版)JournalofHebeiNorthUniversity(NaturalScienceEdition)Vo1.25No.3June.2009鸡肉中呋喃它酮代谢物(AMOZ)残留检测方法一酶联免疫吸附试验苏宪红(唐山中红普林集团有限公司李永强中心化验室,河北唐山063500)摘要:为监测上市鸡肉中兽药残留情况,确定养殖户在养殖过程中对禁用药的控制是否符合国家检测标准,应用间接竞争性酶联免疫方法对合同养殖户随机抽取的15批待上市鸡肉中呋喃它酮代谢物含量进行了检测.取待测鸡腿部肌肉经过16h衍生化及前处理后,取处理后样本加入酶标板.用酶标仪以双波长450/630nm下读取吸光度值,得出样本中呋喃它酮的残留量.经测定,所测15个样本中呋喃它酮含量水平均未超出国家质量监督检验检疫总局0.5g/kg最这个最低检测限,符合国家动物源性食品中兽药残留标准,允许上市和出口.关键词:鸡肉;呋喃它酮代谢物;酶联免疫吸附试验中图分类号:S851.347文献标识码:A文章编号:16731492(2009)030067-04DeterminationofFuraltad0neMetabolite(AMOZ)inChicken_EnzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA)SUXian-hong,LIYong-qiang(thecenteranalyzesroomofTangshanZhonghongpulinGroupCo.Ltd,Tangshan063500,Hebei,China)Abstract:Formonitoringtheveterinarydrugresiduesinchicken,identifyingwhethertheusageoftheveterinarydrugsinchickenfeedingiscompliantwithnationalstandards,anindirectcompetitiveELISAmethodwasappliedtodetecttheAMOZresidueinchickenmeatrandomlycollectedfrom15contractfarmersinLuannancounty.Musclesamplesfromchickenlegweretakenandhomogenized.Afterderivationfor16h,thedrugresiduesinthesampleswereextractedandthendriedwithanitrogenevaporator.Thedryleftoverwasthendissolvedwithsolventandusedforassay.AbsorbancewasmeasuredwithanELISAreaderat450/630nm.ThetestresultsindicatedthatAMOZresidueinalltheiSsamplestestedwereunderthemaximumresiduelimit(MRL),whichwerenotbeyond0.5g/kg,thelowestdetectablelimitofGeneralAdministrationofQualitySupervision,InspectionandQuarantineandaccordedwithveterinarydrugsresidualstandardinAnimalderivedFood.Soitisallowedtocomeintothemarketandbeexported.Keywords:chichenmeat;FuraltadoneMetabolite(AMOZ);ELISAtest呋喃它酮具有非常好的抗菌作用,在临床上主要用于鸡白痢,鸡大肠杆菌病,鸡球虫病等各种肠道感染性疾病的治疗及用作猪,禽类和水产促生长的添加剂r】.但有关研究证明,呋喃它酮及其代谢物具有相当大的毒性和副作用,能诱导有机体基.因突变及致畸胎,且能诱发癌症.1995年起欧盟,151本,美国等开始禁止这类抗菌剂在食用的畜禽及水产动物中使用,并严格执行对输入的食用鱼,虾及禽类进行残留检测4r5.中国农业部2002年2月发布食品动物禁用的兽药及其他化合物清单中明文禁止在所有食品动物的所有用途中使用呋喃它酮.但是,由于其价格便宜,药效好,在很多国家还在继续违规使用.为了保障人民健康及扩大与世界各国动物源性食品贸易往来,必须对动物源性食品中呋喃唑酮进行检测.由于呋喃它酮在体内很快就能被代谢,而在组织中结合的代谢产物(AMOZ)则能存留较长的一段时间,所以药残监测部门经常以检测其代谢产物一AMOZ为手段达到检测呋喃唑酮残留的目的.目前,呋来稿日期:20090320作者简介:苏宪红(1971一),女,天津人,唐山中红普林集团有限公司助理工程师.?67?2009年6月河北北方学院学报(自然科学版)第3期喃它酮检测方法主要有微生物法,色谱法.,免疫分析法等8.微生物法是测定抗生素残留的经典方法,具有前处理简单,经济,批量大等优点,但精确度,准确度和特异性不高g.色谱法应用较普遍,精确度和灵敏度高,但因其流程繁琐,设备昂贵,检测速度慢等原因,很难实现现场检测和普及推广1.基于抗原抗体特异性反应建立起来的酶联免疫检测法具有简单,快速,处理样本量大,灵敏度较高,特异性强等诸多优点,被广泛应用于残留检测.现已有试剂盒供应市场,可以直接用于生产实践.目前,国家质量监督检验检疫总局对出口产品中呋喃唑酮的检测使用的是色谱法,其最低检测限为0.5g/kg.为应用ELISA方法,对滦南县随机抽取的15个组织样本中呋喃它酮代谢物AM0Z含量进行了检测,以确定养殖户在养殖过程中对禁用药的控制是否符合国家卫生标准.1材料与方法1.1样本及制备随机抽取公司养殖户15批待上市肉鸡,将待测鸡屠宰,去毛,取腿部肌肉,用均质器均质混匀,制成组织样本备前处理用.1.2试剂乙酸乙酯(分析纯),正己烷(分析纯),三水合磷酸氢二钾(分析纯),浓盐酸,氢氧化钠(分析纯),去离子水等.1.3材料,仪器设备酶联免疫吸附试验快速检测试剂盒,ModelNo680微孔板酶标仪,Ridasoft.win数据分析软件,氮气吹干装置,均质器,涡旋混合仪,低速台式离心机(2z海安亭科学仪器厂),精密电子天平,电热恒温培养箱,刻度移液管(5ml,10m1),洗耳球,容量瓶(100ml,1L),1Oml玻璃试管,聚苯乙烯离心管(2ml,10ml,50m1),微量移液器,容量瓶,烧杯,玻璃棒,试剂瓶等.1-4试剂的组成与配制1.4.1衍生化试剂向装有2一硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至10ml(浓度为10mmol/L).1.4.2试剂01mol/L磷酸氢二钾溶液;1mol/L盐酸溶液;1mol/L氢氧化钠溶液.1.4.3复溶工作液用去离子水将2浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释用于抗体浓缩液,酶标二抗浓缩液的稀释及提取样本的复溶.1.4.4洗涤液工作液用去离子水将2O浓缩液按1:19体积比进行稀释用于酶标板的洗涤.1.5测定方法1.5.1样本前处理称取1.O土0.05g均质后的组织样本,分别加入4ml的去离子水,0.5ml1mol/L盐酸溶液和100l衍生化试剂,用振荡器充分振荡2min.在37过夜孵育16h.分别加入5ml0.1mol/L磷酸氢二钾溶液,0.4ml1mol/L氢氧化钠溶液和5ml乙酸乙酯,用振荡器剧烈振荡30s.4000r/min,离心10min.取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃试管中,于5060氮气流下吹干.加入1ml正己烷,用涡旋仪涡动30s,再加入1ml复溶工作液,用涡旋仪涡动1min充分混匀.4000r/min,离心10min.除去上层有机相,取下层水相5Ol用于分析.1.5.2测定将所需试剂从冷藏环境中取出,置于室温(2025)平衡30min以上,使用前摇匀.取出需要数量的微孔板.将6个标准品和15个样本对应微孔按序编号,并记录标准孔和样本孔所在的位置.加标准品/样本5Ol到对应的微孔中,然后加入抗体工作液(将抗体浓缩液用复溶工作液按照1:10体积比进行稀释)50l/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25避光环境中反应30min.小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,用洗涤工作液250l/孔,充分洗涤45次,每次间隔10S,用吸水纸拍干,拍干后未被清除的气泡用未使用过的枪头戳破.加入酶标二抗100l/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25避光环境中反应30rain,取出重复洗板步骤.加入底物液A液50l/孔,再加底物液B液50,l/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25避光环境中反应15min.加入终止液50l/孔,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于双波长450/630nm处,在5min内读完数据,测定每孔OD值.1.6数据处理?68?2009年6月苏宪红等:鸡肉中呋喃它酮代谢物(AMOZ)残留检测方法一酶联免疫吸附试验第3期利用Ridasoft.win数据分析软件处理数据.2结果与分析本试验共检测了6个标准品和15个样本.分别测定浓度为0,0.1,0.3,0.9,2.7和8.1ppb呋喃它酮代谢物AMOZ的标准品,应用酶标仪读取吸光度值,采用Ridasot.win数据分析软件进行数据处理,结果见表1,建立标准曲线图见图1.样本测定结果见表2.所测15个样本中呋喃它酮含量水平均未超出国家质量监督检验检疫总局0.5ppb最这个最低检测限,符合国家动物源性食品中兽药残留标准,允许上市和出口.0.10.3O.92.78.1图1标准曲线图表1呋喃它酮代谢物(AMOZ)的标准品检测结果的加加O2009年6月河北北方学院学报(自然科学版)第3期3讨论本试验采用酶联免疫分析方法对15个样本中呋喃它酮代谢物残留进行了检测,从样本测定结果可看出,所测公司合同养殖户15个样本中呋喃它酮含量水平均未超出国家质量监督检验检疫总局0.5ppb这个最低检测限,从而说明此地区养殖户在饲养管理过程中能够根据食用动物的检验检疫的有关规定,科学合理地使用兽药,遵守休药期,规范药品和饲料的使用,严格掌握使用药物的范围和允许使用的饲料,切实做到了在源头上控制好药物残留.本试验中酶联免疫分析方法检测到的样品浓度可达到0.1tg/kg,远远低于国家质量监督检验检疫总局0.5Fg/kg这个最低检测限,表明该方法特异性好,灵敏度高,准确度高.仪器设备投资少,检测成本低,是药物残留检测发展的趋势,用酶联免疫吸附试验试剂盒检测药物残留,能在短短几小时内检测几十到上百个样本,且不需要复杂的仪器设备,样本预处理简单,既可以减少实验室的劳动强度提高工作效率,又可以节约检验费用,同时还可以用于集贸市场肉品安全卫生的现场检验,在现场监控和日常大批量检测中有着十分广阔的应用前景.动物源性食品中药物残留检测一般分为三步进行:样本的采集,样本的前处理,样本的仪器检测.动物组织中成份复杂,样本前处理尤为重要.既要有效去除杂质又要充分回收呋喃唑酮残留成分.提取过程要萃取完全,吹干过程要彻底不能残留有机溶剂,去脂过程也要彻底,避免出现假阳性和假阴性.在应用酶联免疫法进行残留分析时,还需要注意以下问题:试剂盒使用前需充分回温,达到室温2025,如室温过低或过高需使用空调调节,温度将影响整个试验的线性.孵育时要确认位置不透风不透光,否则将影响曲线线性.操作过程中,要用同一个移液枪加同一种试剂,以避免添加量不一致导致线性不佳.本试验中酶联免疫分析方法检测到的样品最低浓度为0.1Fg/kg,远远低于国家质量监督检验检疫总局0.5g/kg这个最低检测限,表明该方法特异性好,灵敏度高,准确度高.仪器设备投资少,检测成本低,是药物残留检测发展的趋势,用ELISA试剂盒检测药物残留,能在短短几小时内检测几十到上百个样本,且不需要复杂的仪器设备,样本预处理简单,既可以减少实验室的劳动强度提高工作效率,又可以节约检验费用,同时还可以用于集贸市场肉品安全卫生的现场检验,在现场监控和日常大批量检测中有着十分广阔的应用前景.参考文献:1张仲秋,郑明.畜禽药物使用手册M.北京:中国农业大学出版社,2000:742KellyBD,HeneghanMA,ConnollyCE,eta1.Nitrofurantion-inducedhepatoxicitymediatedbyCD8+TcellsJ宋阳威.呋喃类药物检验检疫现状及对策EJ.中国动物检疫,2003,20(O3):37唐雪莲,王群,李健.渔用抗菌药物代谢动力学和残留的研究现状J.海洋湖沼通报,2002(O2):6270StehlyGR,PlakasSM,SaidKR.LiquidchrmatographicdecterminationoffurazolidoneinShrimpJ.JAOACInt,1994,77(O4):901904吴健翎,刘芳,沈建昕,等.高效液相色谱