细胞凋亡小泡与CD8 T细胞的交联.doc

细胞凋亡小泡与CD8 T细胞的交联,及对肺结核防预摘要CD8 T淋巴细胞在对抗结核分枝杆菌的预防免疫中起到重要的作用。最近,我们描述了一条在肺结核中CD8T细胞活化的迂回途径，该途径通过来自被感染细胞的细胞凋亡小泡调节，将分枝杆菌性抗原运输到树突细胞(DCs)。这里我们证实在体内，来自分支杆菌感染的巨噬细胞的凋亡小泡,刺激CD8 T细胞。DCs来消耗淋巴结的自导严格要求有效的交联。经核内体内为主的蛋白酶体处理发现在受体DCs中小泡-相关抗原随后死亡。此外，囊泡加工取决于脂结合蛋白得存在来使凋亡膜解体。通过Toll-样受体（TLR）刺激，凋亡小囊泡显示有效的辅助活性。最后，从受感染的细胞接种囊性小泡诱导防预多发性结核感染。综上所诉,我们提出这个迂回路径来代表调节 CD8 T细胞在体内的交联及对肺结核的防预的一个真正的免疫学机制。介绍肺结核是最常见的全世界性细菌感染疾病。免疫对抗它的病原学作用者，结核分枝杆菌，主要涉及CD4 T细胞。然而,CD8 T细胞在保护预防结核病起着至关重要的作用,因为缺乏CD8 T细胞造成对分枝杆菌的攻击更高的易感性。分枝杆菌性肺结核主要感染肺部的巨噬细胞。感染后，分枝杆菌定居在早期吞噬小体内并通过抑制吞噬小体成熟及抑制与溶酶体融合而逃避免疫系统。此外,分枝杆菌抗原在吞噬小体内被隔离,不能穿越进入胞浆。由于CD8 T细胞识别源于细胞质的抗原并使抗原沿MHC-I抗原-表达路径被处理,关键问题一直是CD8 T细胞如何遇到各自分枝杆菌性抗原表位。先前的工作描述在结核病中CD8 T细胞的活化这条迂回途径来克服这一障碍。因此,分枝杆菌诱导被感染的巨噬细胞的细胞凋亡，随后释放含自分枝杆菌抗原的凋亡小泡。这些小泡被DCs吞没，加工处理抗原物为后续提供给CD8 T细胞。因此,这条迂回路径代表了 CD8 T细胞通过吞噬小体-封闭的抗原活化的专用机制。最初,在病毒性感染中发现细胞凋亡和T细胞的活化的关系，病毒性感染中将死的被感染细胞通过共培养的DCs促进CD8 T细胞启动。这一机制涉及从含有抗原供体细胞到受体细胞的转移,最终调节抗原呈递,这一机制被称之为与T细胞的活化相关的交叉呈递或交联。这条迂回路径包括经典交联,后者被证实为多种肿瘤和感染模式。几种病原体包括沙门氏菌和志贺氏菌诱导感染宿主细胞的细胞凋亡。然而,凋亡小泡作为交联剂,还不能确定在这些模型系统中。不同的模式可以解释交联的机理。最新数据显示,抗原呈递细胞(APC)的吞噬小体配备完整的分子装置,要求MHC-I限制性抗原呈递包括抗原呈递相关的转运（TAP）,肽加载复杂,及邻近的蛋白酶体。这表明吞噬小体组成一种自主细胞器，通过主要细胞便利直接的交叉呈递。然而,新的研究不能证实这些结论。因为这条迂回路径是在人类的体外系统中发现,就炎症性过程而言，交联 CD8 T细胞仅仅能代表旁观者通过周围DCs接受，凋亡小泡的活化。研究凋亡小泡路径是否反映了真正的免疫学机制，即在周围组织中通过DCs小泡的跨越摄取，随后移动至耗竭的淋巴结,并且在淋巴组织启动T细胞，我们建立了抗原特异性体内模型。为此,我们使用重组分枝杆菌卡介苗（BCG-OVA）来感染的巨噬细胞。由于宿主细胞固有侵染诱导的凋亡的抑制，我们认为通过被感染的APCs细胞死亡后囊泡形成的外在控制作为最可靠的方法。我们通过来自被感染巨噬细胞的细胞凋亡小泡使小鼠免疫，并采纳性地转移OVA特异性TCR-转基因CD8 T细胞到受体细胞,继而分析CD8 T细胞体内活性。结果分枝杆菌诱导凋亡小泡巨噬细胞感染后，分枝杆菌引起宿主细胞调控的细胞死亡。为了将细胞凋亡形象化，用重组BCG-OVA感染后，我们进行了鼠科的巨噬细胞的Annexin V染色。它将Annexin V 绑定于磷脂酰丝氨酸典型地暴露在凋亡膜的外部小叶。图1A揭示BCG-OVA-感染的巨噬细胞的Annexin V染色的红色荧光,标志细胞凋亡相较于非感染细胞。包括星孢菌素在内，作为凋亡细胞死亡的调控,激活半胱天冬酶-3以及随后的细胞凋亡级联。扫描电镜(SEM)显示了经历了侵染诱导的细胞凋亡的巨噬细胞的囊泡形成(图1B)。值得一提的是,垂死的巨噬细胞通过出芽于细胞索的细胞凋亡小泡表现出一系列显型(图1B,中部)。巨噬细胞的不同超速离心法导致同源的囊泡制备如同SEM指示(图1B,底部)。为检测重组BCG(卡介苗)替代的抗原使否存在于凋亡小泡中,我们通过单克隆抗体对抗卵白蛋白进行了囊泡蛋白质的蛋白印迹。卡介苗表达相当于卵细胞碎片(氨基酸230-359)的w12 kDa带,这些带在来自未感染的巨噬细胞得凋亡小泡中不存在(图1C)。综上所诉,凋亡小泡的产生包括来自BCG-OVA-感染的巨噬细胞的替代抗原证明是完全具有功能的。通过凋亡小泡的CD8 T细胞的交联为了研究在体内凋亡小泡是否激活天然CD8 T细胞,我们通过皮下给于来自未感染或天然巨噬细胞得囊泡制剂使野生小鼠免疫。相平行的,我们从TCR-转基因动物(OT-1)具体为OVA决定素SIINFEKL中分离出CD8 T细胞。随后,在过继转移到接受免疫的小鼠前，我们用荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记OT-1细胞。这种染料随着细胞分裂同样分离,使得增殖模式产生。转移后三天，淋巴细胞从耗竭的淋巴结制备并为CD8染色。流式细胞仪分析揭示，转移的CD8 T细胞通过来自CFSE稀释法标记的受感染细胞的囊泡刺激大量活化表明(图2A,上右)。相反,受体动物通过来自未感染的巨噬细胞的凋亡细胞小泡或来自野生型BCG感染的细胞（不表达OVA）的囊泡进行免疫，得到的CD8 T细胞并没有增殖(图2A左上,数据未显示)。此外,细胞内细胞因子染色显示，通过来自未感染细胞的囊泡的刺激后，相对于OT-1细胞，CD8 T细胞随着分裂产生了大量的干扰素-g(IFN-g)，(图2A,底部)。接下来,我们通过关注T细胞的活化检查与凋亡小泡相关的抗原呈递分子的作用。为了这个目的,我们通过感染的巨噬细胞小泡缺乏b2 微球蛋白(b2m)产生了缺乏MHC-I分子的囊泡。相对于通过由感染细胞派生的囊泡的刺激，通过来自感染的b2m-KO巨噬细胞的凋亡小泡免疫诱导体内固有CD8 T细胞活化，(图2B)。凋亡小泡产生于受刺激的野生型细胞目的为刺激b2m-缺陷动物转基因OT-1细胞引发适度的CD8 T细胞应答(图2C,上)。然而,对细胞增殖程度观察表明，潜在的MHC-I分子从凋亡小泡到b2m-缺陷受体细胞的传递缺乏MHC-I蛋白。为验证这个想法,我们进行了一次体外试验用b2m-缺陷 DCs如APCs和CD8 + 类的OT-1淋巴细胞作为应答器细胞。当缺乏MHC-I的DCs通过来自BCG-感染的巨噬细胞凋亡小泡被脉动，没有测到CD8 T细胞的抗原特异性活化。与之鲜明的对比，增加入来自BCG-OVA-感染的细胞的囊泡诱导健全的T细胞增殖，通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷合体作用确定。OT-1细胞通过来自BCG-OVA-感染的巨噬细胞的囊泡的刺激在缺乏b2m-缺陷DCs中未能引起CD8 T细胞的活化(图2C,底部)。因此,凋亡小泡直接影响OT-1细胞或OT-1细胞调节抗原表达可以被排除。 另外,我们还分析了凋亡小泡的关于其他T细胞种群的交联能力。我们进行了在MHC-II的环境中特异性针对OVA肽的TCR-转基因CD4 T细胞采纳性的转移，用感染或未感染的巨噬细胞的囊泡免疫受体小鼠。图2D表明,来自感染细胞的凋亡小泡有效激活CD4 T细胞。总之,在体内凋亡小泡有效地交联CD8的T细胞。除了抗原呈递外,囊泡能够传递抗原呈现分子到受体APC。囊泡-诱导的T细胞的活化包括CD4T细胞启动。这条便道路径需要DCs的归巢。 因为我们观察到用凋亡小泡皮下免疫接种后位于引流淋巴节CD8 T细胞的活化,我们旨在阐明小泡在外周和淋巴组织之间的运输方式。考虑到小泡运输的两种可能或直接通过淋巴或通过媒介细胞,我们在皮下注射前通过荧光染料标记凋亡小泡，目的是为了测定它们的终点。标记的一天后,我们切除引流淋巴结，制成冻干切片。在组织染色后通过抗体抗DC标志CD11c以及巨噬细胞特异性表面蛋白F4/80，我们在共焦显微镜下检测了淋巴节截面。图3显示为CD11c DCs(+)相互排斥的染色以及在淋巴结截面的巨噬细胞(F4/80 +)(上左)。皮下注射后位于淋巴节点发现红色荧光小泡的几行(图3A,底中部区)。标记的凋亡小泡的位置上叠加在DCs染色上(图3A,底部左)。DCs和小泡的覆盖层很大程度上说明了共区域化，表明凋亡小泡是通过DCs处理(图3A,底部右)。提议在外周部DCs吞没小泡，随后迁移到引流淋巴结。除了这些形态学数据,我们对于DCs的归巢做了功能性实验。我们利用趋化因子受体7(CCR7)缺陷的小鼠，通过天然的和记忆性T细胞以及成熟的DCs表达作为归巢至淋巴组织的前提。我们通过来自BCG-OVA-感染的巨噬细胞的凋亡小泡免疫CCR7-缺陷动物并采纳性地在平行组中转移CFSE-标记的 OT-1细胞。转移三天后，来自淋巴结的细胞被隔离并着色为CD8。流式细胞仪等分析显示相较于在野生动物增生性反应，在CCR7 -基因敲除小鼠中缺乏CD8 T细胞的活性(图3B,上)。为排除CCR72/2固有缺陷小鼠事先指导野生型CD8 T细胞,我们通过SIINFEKL肽并联OT-1细胞转移非脉冲调制或脉冲调制野生型DCs到CCR72/2受体。采纳性转移的三天后，流式分析显示适当的抗原特异性CD8 T细胞的活化(图3B,底部)。综合起来看,我们在CCR7-缺陷系统中的功能试验验证了形态学数据,表示DCs归巢是绝对需要 通过凋亡小泡的CD8 T细胞的交联。凋亡小泡在DCs中的处理因为DCs显示为CD8T细胞通过凋亡小泡交联的中心,我们进一步关注在APCs中小泡的不同处理。一个体外T细胞检验设定骨髓源性DCs作为APCs(抗原提呈细胞)与CD8 + -提纯的OT-1细胞作为应答T细胞进行共培养。通过由BCG-OVA-感染的巨噬细胞衍生的凋亡小泡脉冲DCs后，CD8 T细胞通过抗原特异性增殖进行应答并通过3H-胸苷分割OT-1 细胞合体作用作为记录。在用小泡孵化前通过洛霉素DCs处理并补充T细胞以剂量依存性的方式消除CD8 T细胞反应(图4,上面)。洛霉素阻碍了核内体的H+-ATPase,便利于晚期核内体和溶酶体的酸化。因此,通过洛霉素对OT-1细胞刺激的抑制,证明凋亡小泡的核内体处理对CD8 T细胞活化的重要性。APCs与蛋白酶体抑制剂MG132的预孵化对T细胞活化(图4,上面)。为了排除表现在CD8 T细胞之间的细胞抗原呈递的影响,我们通过来自诱导T细胞的活化失败的感染的巨噬细胞的小泡脉冲OT-1细胞。为了排除使用的化学抑制剂的毒性反应,我们在用洛霉素或MG132孵化前以低(0.1毫克/毫升)或高(1毫克/毫升)浓度的SIINFEKL肽脉冲DCs并随后加入CD8 T细胞。因为T细胞对肽呈递应答的损伤不能被观察到,该抑制剂的任何毒性作用可被排除(图4,上面)。在相同的试验设置中使用卵清蛋白(5毫克/毫升)显示在存在MG132中T细胞应答终止,表明蛋白酶体在 CD8 T细胞通过可溶性蛋白交联中的重要性(图4,底部)。为评估蛋白酶体和溶酶体酸化的效能，我们在抑制剂下at a moi of5通过重组表达OVA的单核细胞增多性李斯特氏菌(L.m.-OVA)感染DCs溶酶体。由于李斯特菌的作用,感染后李斯特菌能诱发膜孔逃脱吞噬小体迅速到达细胞质。这使我们得以对细胞质蛋白质的处理研究MG132的影响。图4(下部)展示了由于蛋白酶体的缺陷抗原识别的完全阻滞。自从李斯特氏菌施展在酸性环境中最优活性以来，核内体的腔隙的中和作用同样减少了T细胞的活化。最后,探讨洛霉素和MG3在MHC-II限制性抗原呈递中的影响,我们在与抑制剂孵化前用卵清蛋白(5毫克/毫升)脉冲DCs并加入卵清蛋白-特异性CD4 T细胞(OT-2)。核内体酸化有效的抑制终止CD4 T细胞抗原识别,而蛋白酶阻滞起不了什么作用(图4,底部)。综合起来看,核内体为主的涉及抗原处理的蛋白酶体机制包括凋亡小泡为之后CD8 T细胞诱导。因为我们确定了溶酶体腔隙对凋亡小泡的抗原编辑是极其重要,我们就问对小泡处理是否还需要有其他溶酶体的辅助分子。先前研究描述为脂结合蛋白作为脂质呈递蛋白质位于溶酶体与溶酶体内的小泡相互作用。从而使脂结合蛋白破坏膜结构稳定并暴露它们的成分为进一步的处理。凋亡和溶酶体内的小泡在结构上显示一些类似。此外,脂结合蛋白对典型地暴露在凋亡膜表面的磷脂酰丝氨酸具有高亲和力。因此,我们提出了脂结合蛋白的在凋亡小泡的解体一个作用,通过来自鞘脂激活蛋白原缺陷小鼠的DCs进行实验，脂结合蛋白 A-D的前体蛋白,用于CD8 T细胞的活化。当来自鞘脂激活蛋白原-缺陷动物的APCs以不同浓度的来自BCG-OVA-感染的巨噬细胞的小泡被脉冲，CD8 T细胞应答相对于杂合的或野生型控制DCs的刺激显著减少(图5)。通过在细胞培养基中添加重组鞘脂激活蛋白原鞘脂激活蛋白原-缺陷的APCs再构成，T细胞应答在很大程度上恢复。以不同浓度的SIINFEKL肽装载鞘脂激活蛋白原-敲除的APCs诱导一个有力的CD8 T细胞应答,显示了另一个生理性的MHC-I-限制性抗原呈递能力(图5)。此外,可溶性的卵清蛋白(5毫克/毫升)的增加显示了通过鞘脂激活蛋白原-缺陷 APCs相对于杂合的或野生DCs使T细胞活化的一个同等的重要性(图5)。因此, 在抗原加工中由于鞘脂激活蛋白原的缺乏所致的广泛的缺陷可以被排除。此外,我们以前证明,鞘脂激活蛋白原-缺陷细胞的溶酶体腔隙结构上未受损伤而这一点与-葡萄糖苷酶类如b-己糖胺酶和b-半乳糖苷酶等有所区别。综上所述,缺乏鞘脂激活蛋白原削弱CD8 T细胞的活化,证明脂结合蛋白在凋亡小泡处理中起作用。凋亡小泡是佐剂生产T细胞应答都依赖于通过像巨噬细胞和DCs一样强有力的APCs进行充足的抗原呈递。成功的T细胞引导通过APCs的活化而变得容易。病原体具有保守的分子,例如脂多糖（LPS）或者细菌脂蛋白(BLP)，通过Toll-样受体刺激APCs。我们决定是否来自BCG-感染的巨噬细胞的凋亡小泡配备分枝杆菌性配基通过TLRs刺激。为此,我们使用稳定表达TLR-2 受感染的293HEK细胞系,与NF-kB-控制的荧光素酶受体质粒短暂地共感染。在TLR-2连接反应后,接头分子髓性区化因子88（MyD88）的募集导致NF-kB活化和随后荧光素酶的表达。共转染一天后,细胞与大量的来自感染或未感染的巨噬细胞的凋亡小泡一起培养。6小时后，细胞被溶解并测试NF-kB-依赖性 荧光素酶活力。在剂量依赖的方式下来自分枝杆菌感染的巨噬细胞的凋亡小泡与来自未感染的细胞的小泡对比引发NF-kB激活（图6A）。为了扩大我们对从报道细胞系统到更自然的条件的深刻见解,我们用凋亡小泡刺激缺乏TLR-2，TLR-4,或MyD88主要的APCs。来自各自基因敲除动物的DCs或巨噬细胞被脉冲,无论是用来自感染或未感染细胞的小泡或卡介苗。随后,细胞培养来分析IL-12或TNF-a的分泌。在野生型DCs来自受感染细胞的小泡诱导大量的IL-12,在很大程度上减少了,TLR-2 TLR-4 -,和MyD88-KO DCs，而卡介苗刺激导致通过野生型以及TLR-4-KO DCs分泌IL-12 / IL-23p40(图6B)。相对于野生或TLR-4-KO巨噬细胞,小泡也未能引起TLR-2-缺陷巨噬细胞分泌TNF-a(图6C)。与此一致的发现,缺乏接头分子MyD88的细胞被来自感染巨噬细胞的小泡激活。总之,在来自分枝杆菌感染的细胞的凋亡小泡通过激活TLR-2衔接表现出很强的APCs佐剂活性。 为了描述分支杆菌所含凋亡小泡,我们通过来自小泡的蛋白质进行了免疫印迹，小泡来源于分支杆菌感染的细胞及对比的未感染细胞。图6D展示了通过一个克隆抗-BCG免疫血清测得分枝杆菌性蛋白大量的带呈现在小泡中。这些蛋白质中的一种与表达Ag85的w31 kDa带相符合,Ag85是一个防御性抗原通过M.肺结核和BCG共享,通过特定的抗体显示(图6D)。另外,通过免疫印迹法检测到代表抗原和佐剂的分子。因此,分支杆菌19 kDa脂蛋白，绑定于TLR-2并充当T细胞抗原，出现在被感染巨噬细胞的凋亡小泡中(图6D)。综上所诉,分支杆菌蛋白,如19 kDa脂蛋白是囊泡蛋白内含物的组成并授予凋亡小泡强劲的佐剂性。 用凋亡小泡接种疫苗防止肺结核因为来自分支杆菌-感染细胞的凋亡小泡运载抗原,抗原呈递分子以及佐剂,他们能有效激活CD4以及CD8 T细胞。因此,我们研究防御效果小泡-为基准的抗结核分枝杆菌感染的疫苗。我们对C57BL / 6小鼠用来自泡在BCG-感染或未感染巨噬细胞的凋亡小泡接种疫苗，皮下注射间隔10天共两次。作为阳性控制组,我们包括了用BCG免疫动物现有的预防结核病的疫苗。最后一次免疫的10天后,我们用低接种物M.肺结核通过气雾剂感染激发小鼠。在20天和感染后50,我们从实验动物中收集肺、肝脏以及脾脏,并在7H11琼脂连续对倍稀释搅匀器官。三个星期后,对结M.核分枝杆菌群体计数并测定每毫升器官的菌落数。，来自未感染细胞的小泡未能防止多发性结核感染相当于未接种组(图7)。鲜明的对比,在20天和50天在肺和脾中按BCG-诱导的防御确定用来自分支杆菌-感染的巨噬细胞的凋亡小泡疫苗接种疫苗诱导气雾剂-激发的防止（图7A-7C）。用来自感染巨噬细胞的小泡接种免疫组或BCG和未接种免疫组或那些用来自未感染巨噬细胞的小泡接种免疫组，各组之间菌落数有著显著的统计差异。由于未接种免疫小鼠自发的细菌的重荷减少,在50天时肺菌落数在未接种免疫动物中相对于在接种免疫动物中要高然而无统计学意义(图7B)。然而,在感染后同一时间点，在脾脏中相较于未免疫接种组小泡-为基础的疫苗诱导的防御具有意义(图7C)。综上所述,用凋亡小泡接种的疫苗防止肺结核。 讨论本研究的目的是研究CD8 T细胞活化的这条便道传导是否在体内有可操作性。基于之前的工作重点在于分析人类体外系统,剩下的问题是凋亡小泡是否代表一条特有的免疫学机制,而不仅仅是旁观者活化为炎症过程所特有。因此,我们用来自BCG-OVA-感染的巨噬细胞凋亡小泡建立了特异性模型为小鼠的免疫通过采纳性转导接受OVA-特异性CD8T细胞 。DCs吞噬这些小泡进行深加工，抗原激活CD8T细胞否则在吞噬小体中被隔离。我们通过扫描电镜的侵染诱导细胞凋亡的研究显示一串分支杆菌感染巨噬细胞的表型显示从细胞带形成的小泡。在引流淋巴节来自结核分枝杆菌-感染的巨噬细胞的凋亡小泡皮下免疫接种诱导CD8 T细胞的活化。因此,通过凋亡小泡的交联发生在体内。尽管在一些病毒和肿瘤系统中的数据相互矛盾,但交联的重要性已经在众多的通过肿瘤感染以及诸如OVA的确定抗原的模型中被确认。通过病原体-诱导的凋亡发起的交联被用于描述通过病毒和细菌的感染。几个病原体诱导宿主细胞中的凋亡,这表明这条便道路径代表了传染病中CD8的T细胞交联的一个普遍的机制。在单核细胞增生利斯特菌感染中,已被证明中性粒细胞对李斯特菌-特异性 CD8 T细胞的交联起着决定性的作用。此外,中性粒细胞是李斯特菌和其他致病入侵物的主要靶向细胞,并在感染后经过细胞凋亡。因此,很有可能这条便道路径对多种交联条件有效。然而,凋亡小泡在这些模型不能被鉴定。不同的囊泡结构也被描述为在T细胞交联中的有效因子,称为外切体。这些小泡代表分泌的溶酶体,是细胞结构性释放的，与细胞死亡无关。抗原的外切体转移作为迂回路径的一部分已被排除,因为在供体巨噬细胞中凋亡抑制完全消除CD8 T细胞的激活。CD8 T细胞被来自分支杆菌-感染的细胞产生IFN-g的凋亡小泡激活，这是控制结核病中心所在。值得注意的是,IFN-g刺激未感染巨噬细胞产生活性氮中间体为了有效地杀死细胞内结核分枝杆菌。此外,我们检测了凋亡小泡相关的抗原呈递分子对T细胞的活化的影响。当小鼠通过来自缺乏MHC-I表面表达的 b2m-缺陷的巨噬细胞的小泡进行免疫,观察到如通过抗原特异性增殖所示的适当的CD8T细胞的活化。因此,凋亡小泡中MHC-I分子的存在并非交联所需要。在b2m KO-受体小鼠中来自野生型巨噬细胞的小泡诱导一定的,但是微弱的CD8 T细胞增殖,这表明在体内发生MHC-I分子从凋亡小泡到受体APCs转移。然而,微弱的T细胞反应可能是由于MHC-I蛋白定量小转移。为了验证MHC-I穿透率,我们用凋亡小泡脉冲来自b2m-KO小鼠的DCs为随后的T细胞体外刺激。事实上,为MHC-I-限制性抗原呈递凋亡小泡重组了b2m-缺陷 APCs。此外,我们论证了抗原特异性CD4 T细胞被凋亡小泡活化。MHC-II-限制性 CD4 T细胞在预防结核病保护性免疫反应中发挥着重要的作用,MHC-II-限制性 CD4 T细胞被外源性抗原通过核内体途径激活。在结核病中交联对CD4 T细胞的活化同样很重要,因为由于分支杆菌通过IFN-g信号传导的干扰，被感染的巨噬细胞在MHC-II呈递中受阻。最近的数据显示,在体内DCs负责CD8的T细胞的交联。因为我们观察到引流淋巴节点T细胞的活化,我们实验性地决定抗原如何从外周被运送到淋巴组织。皮下注射荧光小泡后,随后的DCs和巨噬细胞在引流淋巴节点的着色证明了小泡对DCs的专有定位。结在周边组织，为后续的运送到引流淋巴，DCs对颗粒抗原的摄取是与研究相符合的，该研究表明,为细胞-单独运输至次要淋巴器官，可溶性而不是微粒抗原可以直接被淋巴引流。此外,通过凋亡小泡对CCR7-缺陷动物的免疫没有诱导CD8 T细胞的活化。CCR7表达于天然和记忆T细胞以及激活的DCs,被严格地要求归巢到淋巴组织。CCL21和CCL19是CCR7的主要配体,生产于淋巴管和大量内皮小静脉的内皮细胞以及基质细胞和淋巴T细胞区的成熟DCs。我们的结果表明,DCs的归巢是通过凋亡小泡的CD8 T细胞交联的一个先决条件。通过化学抑制剂在两个途径中作用显示，在受体DCs中凋亡小泡中含有抗原的加工主要涉及核内体机理而不是蛋白酶体分裂机理。这与最新数据发现对TAP的依赖性以及通过细胞相关抗原交联的蛋白酶体形成对比。可以设想独立地来自于蛋白酶体的抗原加工的两项。首先,在一个已经处理的直接可供MHC-I粘附组成中，OVA可以出现在凋亡小泡中。我们认为这项不可能,因为我们通过凋亡小泡的免疫印迹分析发现完整的OVA分子。更重要的是,最近的研究显示交联抗原的性质由蛋白质的成熟规定。比成熟蛋白质半衰期短不稳定的多肽不能够交叉呈递。第二,OVA可以被受体APCs处理独立于蛋白酶体分裂。事实上,最近的实验结果确认一个抗原的独特的核内体机制，用于交叉呈递，通过组织蛋白酶S调解不涉及TAP和蛋白酶体。凋亡小泡代表膜结构,这应该是被解体来作为为他们的抗原内容物的进一步处理的前提。脂结合蛋白 A-D是脂质传递蛋白存在于溶酶体由普通的前体或鞘脂激活蛋白原的裂解所产生。脂结合蛋白具在结合蛋白质和脂质中有双重功能,它们是必要的酶类辅助因子涉及脂质降解。此外,脂结合蛋白与磷脂膜结合，从而破坏溶酶