转基因食品的检测方法材料.doc

转基因食品的检测方法自1983年世界第一例转基因作物问世以来，目前全球转基因农作物种植面积已达到5 000万hm2以上，大量的转基因农产品被直接或间接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。但是转基因作物作为一种新物种，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。许多国家以立法或其他形式要求对转基因产品进行标记。我国于2001年5月23日颁布农业转基因生物安全管理条例，2002年3月20日开始实行的农业转基因生物标识管理办法规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。世界各国均对转基因食品及其加工产品出具是否为转基因产品的认定报告。因此转基因产品的检测就显得尤为重要。转基因食品的检测主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测方法进行综述。1核酸水平主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。11定性检测111聚合酶链式反应(PCR) 1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Btl76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为05转基因成分。Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了14对检测该7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因的引物，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计引物的特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。曹际娟等对转基因玉米及其粗加工食品，如爆米花、熟玉米棒、速溶玉米片的基因进行了PCR定性检测，指出利用该方法检测外源基因成分含量的底限可达到01。目前，该方法在检测转基因食品的应用中，还存在一些问题，如从食品中提取DNA的效率，可能存在的PCR抑制剂， DNA的降解，可能存在的RNA，以及选择合适的靶序列的引物来保证扩增的成功等，这些都可能成为制约鉴定结果成功与否的因素。在实验过程中，PCR的污染及条件的重复性是实验判定结果的关键。每一次实验均需要设有阴性及阳性对照以确保实验结果可靠性。在样品采集及处理过程中也需要注意防止污染。112多重PCR多重PCR是常规PCR方法的改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。多重PCR可以同时针对几个靶位点进行PCR技术检测。VTForte等利用其设计的多重PCR方法对转基因大豆和Bt玉米样品进行实际检测，结果表明该方法能够准确的检测食品中是否含有转基因成分，其检测结果可以精确到201的范围。Permingeat等仅用两对引物就可同时检测出转基因玉米Btl76、 MON810、Btll和T25的CrylA(b)和pat基因。多重 PCR也可同时准确地扩增出Roundup Ready大豆的 NOS和epsps序列片段。113巢式和半巢式PCR(nested PCR and semi-nested PCR） 巢式PCR(nested PCR)是在普通PCR基础上发展起来的一种PCR技术。其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测。 半巢式PCR(semi nested PCR)的原理与巢式PCR基本相同，只是半巢式PCR只有一对半引物，有一个引物被用于二次PCR反应中。这两种方法不但可以减少假阳性的出现，而且可以使检测的下限下降几个数量级。在DNA受到严重破坏的大豆加工品豆油、大豆磷脂以及其它产品中，用普通PCR不能完全检出是否含有大豆成分和转基因大豆的成分，即使检出，其重复性也不好。而利用巢式PCR和半巢式PCR可以克服普通PCR的这一缺陷。在用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测时，可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(house-keeping gene SLectin。其中2种食品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出外源基因 CaMV35SCTP4基因片段，说明这些食品中含有转基因大豆成分，占被检测食品的765。114核酸印记法(southern blot) 以放射性或荧光标记的外源目的基因的同源序列作为探针与该食品原料农产品的总DNA进行杂交。首先用限制酶消化受体总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片断，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片断的相对位置保持不变，用放射性或荧光标记的探针与各个DNA片断杂交，经放射自显影确定与探针互补的电泳条带的位置。核酸印记法技术用于食品外源基因的检测可检测出外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断，且准确可靠，但对样品的纯度要求较高，费用也较高。Wu等用核酸印迹法判断出西红柿的假定的转化株的基因组DNA中含有转入的DNA。Jennings等用核酸印迹法杂交判断Bt玉米中crylAb基因的211 bp片段和玉米内源基因sh2(编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶)的213 bp片段的存在。这种方法准确但是操作复杂费时。1.2定量检测121竞争性PCR 通过比较要扩增的样品中目标DNA和在同一体系中进行扩增的已知量的竞争性DNA而得到的，竞争性DNA必须与目标DNA具有相同的引物和不同的分子量，以便二者既能同时进行扩增反应又能使扩增后的两种产物通过凝胶电泳区分开来。Anastasia k等在竞争性PCR的基础上，对双竞争性定量PCR(Double cmantitative competitive PCR，DCPCR)进行了研究，并与实时PCR进行了比较，证明竞争性PCR具有灵敏度高、探针价格更低廉的优点。122实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescence Quantitative PCR)这是在转基因食品检测中非常重要的一种检测技术。在该体系中，除了两条普通的引物外，还有一条在5和3端分别标记了报告荧光染料基团(R)、粹灭荧光染料基团(Q)，并与PCR产物特异片段结合的寡核苷酸探针。荧光染料也有报道用SYBR Green021。陈颖等利用该方法对转基因玉米Mon 810和Event 176的定量检测低限均小于001031。刘冰峰等利用该方法对转基因烟草K358进行了检测。它通过分析起始拷贝数的方式以标准品制备标准曲线，从而判定待检产品中的转基因含量。在整个检测过程中闭管操作，使用荧光染料特异标记PCR产物，实时显示PCR产物的动态积累，且没有繁杂的后续处理过程，避免了产物的污染，方法快捷、灵敏、有效。123多重荧光PCR多重PCR和实时荧光定量PCR的结合，刘光明等利用该技术对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄共11份实物样品进行检测，结果显示马铃薯样品2份及大豆、玉米、甜椒样品各l份中检出35S和Nos双组分，另6份样品均未检出。124 PCRELISA定量这是一种将PCR的高效性与ELISA高特异性结合在一起的检测方法，它利用地高辛或生物素等标记引物，将PCR扩增产物与固相板上特异的探针结合，再加入抗地高辛或生物素的酶标抗体辣根过氧化物酶结合物，最后使底物显色，在酶标仪上读取数值。它快速方便，避免了有毒物质EB的使用，适合大批量自动检测。利用这种方法，可以在2 h之内检测到扩增子含量仅为01 ng的样品，对于大豆粉可以检测到转基因组分含量为0120的范围。125基因芯片(Microarray)技术它具有PCR方法的相同优点，可以精确地进行 GMO的定性检测。不同之处为可在固体表面固定上千个特定的探针，能够一次单独分析样品中的大量的不同种类的GMO，进行筛查、定性、定量，具有高通量、集成化和自动化的特点。此外，微阵列技术非常灵活，当有新的GMO出现时可以在阵列中增加布点，将新的基因序列包括在筛查程序中。126生物传感器(Biosensor)技术 意大利科学家Mascini课题组在生物传感器检测转基因食品的研究处于领先水平。在此实验中，核酸传感器可与溶液中的目标基因片段结合达到检测的目的。DNA探针固定在传感器的表面，目标基因片段游离在溶液中，二者的杂交实时进行。DNA探针的序列一般是通用的35S启动子和NOS终止子。有两种不同的探针固定方法在食品检测中可以提高水晶 DNA传感器的压电，即硫代糊精一链霉素一生物素程序 rthiol dextran streptavidin biotin procedure)和硫代衍生化探针及阻断硫代程序(thiol derivatised probe and blocking thiol procedure)。课题组发明了一种石英晶体微量天平设备。该设备的独特之处在于其石英表面上固定着许多金电极。可以应用于质粒的提取以及基因组DNA和PBll21质粒的分离。被鉴定的物质和实时系统可以通过和PCR联合而加强。分析参数(如灵敏度、重复性、有效时间等)表明生物传感器技术是一种有效的检测转基因食品的方法。2蛋白质水平上的检测21蛋白质印迹法(Western blot)蛋白质印迹法将电泳较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来，是检测复杂混合物中特异蛋白质的最有力的工具之一。普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质，灵敏度为1 ng5 ng。它可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质，特别用于不可溶蛋白质的分析。van Duijn等用蛋白质印迹法检测Roundup Ready大豆中的 CP4合成酶，检测限在05一1。验证该方法可对大豆蛋白质产品进行检测。22酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA) Rogan等用ELISA法检测出传统大豆加工产品中混有2Roundup Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白质。这种蛋白质检测方法具有商业可利用性并具有高度选择性和灵敏性。免疫测定的主要缺点之一是复杂基质对它的准确性和精确度有干扰，如加工的蔬菜和食品。实际上，许多存在于食物基质中的物质，如表面活性剂(皂角苷)、酚化物、脂肪酸、内源磷酸(酯)酶，均可以抑制特异的抗原一抗体相互作用。此外，外源基因表达的蛋白质在较低水平时或热处理变性时，免疫方法的检测能力下降。某些导入蛋白质并不是在植物的所有组织中均有表达，例如在玉米中一些蛋白质大部分表达在叶子中，而不在谷粒中。特别需要指出的是，在加工过程中蛋白质会发生降解，因此这种技术只适合未加工的原材料的检测。而且如果导人的DNA的蛋白质没有表达，也不能应用这种技术。DNA比起蛋白质具有更多的热稳定性，能够在食物加工过程中存留。23“侧流”型免疫测定(Lateral Flow)。“侧流”型免疫测定是在最近15年发展起来的，该方法之前主要用于医学领域。与ELISA相似，这种测定方法也是基于三明治夹心式技术原理，但该法是在一种膜支持物上，而不是在管子里进行的，标识的抗原一抗体复合物侧向迁移，直至遇到在一种固定表面上的抗体。整个操作相对简单，目前市场上也出现了用于侧流分析并能用于野外测试的试剂盒。3其它检测方法随着国内外对转基因产品检测研究的深入以及各国对转基因产品检测要求的提高，迫切地需要更准确、快速、安全、高效且成本低廉的检测技术的问世。除了上面介绍的方法外，还有一些其它的检测方法。目前，色谱技术(HPLC)、近红外波谱技术(NIR)、毛细管电泳技术(CE)、超分支滚环扩增技术(HRCA)以及基于一些成熟技术建立起来的试剂盒技术、试纸条技术在转基因食品的实际检测中都有所应用。4结束语 转基因食品的检测方法多种多样，各有其优缺点。在实际的检测中，并非任何一种检测方法对某种转基因食品的检测都行之有效。应该根据食品种类和加工类型的不同，以及食品中可能含有的转基因片段的不同，选择最有效的检测方法。同时，现有的检测方法也在不断的改进中，随着各国有关转基因成分标签法的建立和不断完善，对转基因成分的准确定量检测显得日趋重要。这就要求，转基因食品的检测方法向着高质量、高灵敏度、高准确性、自动化和低成本的方向发展。 转基因产品检测仪器转基因产品的检测，就是检测产品中有否外源基因，其实是检测启动子、终止子、标记基因片断、目的基因片断、外源基因转录产物的丰度等。就方法而言，又分为基因水平的检测（各种PCR扩增、定性、定量方法和基因芯片技术）和基因转录水平检测（