重组人源化兔抗vEGF单克隆抗体的抗原结合活性测定_577.doc

重组人源化兔抗vEGF单克隆抗体的抗原结合活性测定范文红 毕华 饶春明*中国药品生物制品检定所重组技术产品室 北京 100050【摘要】目的 采用直接ELISA法检测重组人源化抗vEGF单克隆抗体的抗原结合活性。方法 以固定量的vEGF-Fc做包被抗原，辣根过氧化酶标记的抗人IgG（H+L）为二抗，直接测定不同浓度参考品和供试品与抗原的结合活性，通过数据处理软件对结果绘图，根据供试品及参考品EC50值计算供试品的相对结合力。结果 重组人源化兔抗vEGF单抗供试品及参考品在该方法中均存在量效关系，且符合四参数方程。同一批次的供试品原液每次3支、分别经3次测定，相对结合活性分别为参比品的（90.4318.74）%、（123.5618.4）% 和（106.8318.47）%，平均值（106.9416.57）%。3次试验的变异系数分别为20.72%、14.89%和17.29%。同一批次的供试品成品每次3只、分别经3次测定，相对结合活性分别为（97.3418.42）%、（123.3011.08）%和（93.914.57）%，变异系数分别为18.93%、8.96%和4.87%。结论 直接ELISA法精密性良好，结果客观，影响因素少，可用于重组人源化兔抗vEGF单抗抗原结合活性的常规检测。【关键词】重组人源化兔抗vEGF单克隆抗体；相对抗原结合力；直接ELISA*通讯作者：饶春明（010）67095380, Email: Measurement of the Antigen Binding Activity of the Humanized Anti-vEGF Rabbit Monoclonal Antibody Fan Wenhong, Bi Hua, Rao Chunming（Department of Recombinant Technological Products, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products of China, Beijing 100050）【Abstract】 Objective To determine the antigen binding activity of the humanized anti-vEGF rabbit monoclonal antibody by direct ELISA. Methods The reference and the samples of humanized anti-vEGF rabbit monoclonal antibody were serially diluted and allowed to incubate with a fixed amount of recombinant vEGF-Fc. The EC50 of reference standard and the samples would be determined by fitting a 4-parameter equation. The binding potency of the samples would be expressed as a percentage of the EC50 to that of the reference standard. Results The average binding potency of the humanized rabbit monoclonal antibody bulk was (106.9416.57)%，from 3 times tests of 9 vial samples of the same batch，which meet the requirement of their quality control. The results were (90.4318.74)%, (123.5618.4)% and (106.8318.47)% respectively. The relative binding potency of the final products were (97.3418.42)%, (123.3011.08)% and (93.914.57)%. The CVs of three tests are 18.93%, 8.96% and 4.87% respectively. Conclusions The results showed that direct ELISA is a repeatable and stable method to detect the relative binding affinity. The method could be used as a routine analysis in the quality control of humanized anti-vEGF rabbit monoclonal antibody.【Key words】humanized anti-vEGF rabbit monoclonal antibody; relative binding potency; direct ELISA血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，vEGF）是由某些肿瘤细胞分泌的促进血管生成的因子，通过与血管内皮上的相应受体结合促进内皮细胞增殖，同时可增加血管通透性使内皮细胞迁移，诱导肿瘤血管生成，维持肿瘤的继续生长，是目前发现的最强烈的血管生成因子，与诸多生理及病理过程有关1-3。已有研究结果证明，多种实体瘤中存在vEGF的过表达，这就使vEGF成为肿瘤治疗的靶点4,5。肿瘤抗血管生成治疗理论在上世纪70年代就已经提出，到上世纪90年代，研究人员揭示了血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤血管生成过程中的重要作用，并研发了抗VEGF单克隆抗体和小分子靶向药物，如贝伐单抗（Avastin）、vEGF Trap 等6-10。1995年，芝加哥大学的KatherineKnight博士成功地在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤(plasmacytoma)。其后几年里，此技术经改进，能高产量地生产兔单克隆抗体。兔抗血清通常含有高亲合力抗体，可以比鼠抗血清识别更多种类的表位。其次，兔单克隆抗体能够识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原。另外，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。目前，作为治疗性抗体的人源化兔单抗的研究正在进行中11-13。作为治疗性抗体，其与抗原的结合能力是判定此类抗体性能参数中一个重要指标，是其质量控制的关键。我们采用直接ELISA法测定系列稀释的重组人源化抗vEGF单克隆抗体与vEGF-Fc的相对结合活性，该法简单迅速，精密度高，重复性好，可以作为此类抗体相对抗原结合活性的检测方法。1. 材料与方法1.1 供试品 重组人源化兔抗vEGF单克隆抗体参比品、1批原液和1批成品均为本室留样。1.2 主要试剂及仪器重组vEGF-Fc (0.675 mg/ml) 为本室保存，辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG（H+L）为Jackson ImmunoResearch 公司产品，TMB为美国Amresco公司产品。Spectra Max Gemini XS 酶标仪及SOFT MAX 分析软件为美国Molecular Devices 公司产品。1.3 抗原包被浓度及供试品稀释浓度的优化用包被液将重组vEGF-Fc从8 g/ml开始依次进行2倍稀释，共8个浓度梯度。用样品稀释液将供试品分别从1.6 g/ml开始依次进行2倍稀释，共12个浓度梯度，进行正交实验，选出合适的抗原包被浓度及供试品的起始浓度。1.4 重组人源化兔抗vEGF单抗相对结合活性的检测用稀释液（含 0.1% BSA的PBS溶液）将重组人源化兔抗vEGF单抗参比品（2 mg/ml）、供试品原液(31.41 mg/ml)和成品（10 mg/ml） 稀释至优化好的起始浓度，再进行2倍系列稀释，共8个稀释度，同时设空白对照孔，每个稀释度设2个复孔，每孔100ml。室温放置2小时进行结合反应，洗板后加入1：10000稀释的酶标抗体，室温反应1小时，洗板后TMB显色15分钟，加终止液。使用Molecular Devices 酶标仪，在450 nm处测定各孔的吸光值。利用SOFT MAX 分析软件，以人源化叶酸受体单抗参比品及供试品浓度的对数值为横坐标，A450吸光值为纵坐标，进行四参数方程曲线拟合，得出参比品和样品的半数有效浓度（EC50）。按下式计算重组人源化抗vEGF单克隆抗体的相对结合活性。相对结合活性（%）=供试品的EC50 /参比品的EC50100%1.5 精密性试验 按1.4相方法重复3次测定，每次3支重组人源化兔抗vEGF单抗供试品，计算变异系数（CV%），验证该方法的精密性。2结果2.1 抗原包被浓度及供试品稀释浓度的的优化结果 通过正交试验结果可知，抗原包被浓度为0.25 g/ml，供试品浓度在50 ng/ml到0.5ng/ml之间时，抗原抗体结合信噪比较高，在半对数坐标上呈现典型的S型曲线（图1）。图1. 抗原包被浓度和供试品稀释浓度的优化结果Fig 1. The optimized results of the coating concentration and the sample dilution concentration 2.2 重组人源化兔抗vEGF单抗的相对结合活性的测定结果重组人源化兔抗vEGF单抗参比品和供试品的抗原结合均存在量效关系，符合四参数方程，相关系数在0.98以上，剂量反应曲线见图2。重组人源化兔抗vEGF单抗原液和成品每次3支、重复3 次试验的EC50值见表1，原液的相对结合活性分别为（90.4318.74）%、（123.5618.4）% 和（106.8318.47）%，平均值为（106.9416.57），3次试验的变异系数分别为20.72%、14.89%和17.29%。成品3次试验的平均相对结合活性分别为（97.3418.42）%、（123.3011.08）%和（93.914.57）%，变异系数分别为18.93%、8.96%和4.87%。图2 重组人源化兔抗vEGF单抗参比品和供试品的抗原结合曲线Fig. 2 Binding curves of the reference and samples 表1 重组人源化兔抗vEGF单抗原液和成品的相对结合力Tab1. The relative binding affinity of the bulk and final product of humanized rabbit monoclonal antibody against human vEGF样品参比品EC50供试品EC50相对百分效价(%)CV（%）原液13.7693.941104.5620.7222.60769.1733.67797.5614.3604.897112.3214.8924.951113.5636.313144.7915.7624.96786.2017.2926.480112.4637.020121.83成品14.4075.225118.5618.9323.76785.4833.87787.9715.5296.741121.928.9627.464135.036.246112.9716.6525.98489.964.8726.17692.843讨论治疗类生物制品中，重组抗体的抗原结合活性是抗体效应功能发挥的首要条件5。因此，抗体的抗原结合活性测定也是反映产品特定生物学效应，即与特定抗原结合能力的重要指标，可以作为抗体类生物制品的生物学活性测定的补充。本试验中经系列稀释的重组人源化兔抗vEGF单抗与固定量的vEGF-Fc结合后，进行直接ELISA测定，通过四参数方程拟合，测得重组人源化兔抗vEGF单抗结合vEGF-Fc的半数有效浓度（EC50），EC50值越低，说明其相对结合能力越强，通过与参比品 EC50 值的比较，即得其相对百分效价。该方法操作步骤简单，结果真实客观，影响因素少。验证试验表明，本室留样的重组人源化兔抗vEGF单抗的相对结合活性符合 65%150% 的要求范围。本文介绍的直接ELISA测定抗体的抗原结合活性方法，为同类治疗性抗体或相关制品的生物学活性质量控制奠定了一定基础。参考文献1. Senger, D. R., Galli, S. J., Dvorak, A. M., Perruzzi, C. A., Harvey, V. S., and Dvorak, H. F. (1983) Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. 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