高级微生物学结课论文-昆虫病原真菌研究进展

高级微生物学结课论文高级微生物学结课论文 院院系系 级级别别 学学年年 学学期期 姓姓名名 学学号号 类类别别 全日制硕士全日制硕士 全日制博士 全日制硕士 教育硕士 高师硕士 工程硕士 农推硕士 兽医硕士 进修 2014 年 12 月 21 日 昆虫病原性真菌研究进展昆虫病原性真菌研究进展 摘要摘要 昆虫病原性真菌是引起昆虫外源侵染性疾病 甚至控制昆虫行为的一类真菌 昆虫病原 性真菌的寄主范围广 在行为及毒力方面的表现千差万别 在人类漫长的发展史中 病虫害 防控的手段也逐步从化学手段晋升为生物手段 这也是昆虫防控领域的研究方向逐渐向生物 杀虫方面过渡的重要原因 但迄今为止 在昆虫的合理开发应用方面 人们在相关领域的研 究还不够明晰 本文对现行研究的昆虫病原性真菌的生物学分类 杀虫功能发挥的机制及基 因工程研究方法三方面进行了讨论与总结 为病原真菌的毒力发挥 参与杀虫剂情况做相应 评论及阐述 关键词关键词昆虫病原性真菌 生物杀虫 毒力发挥 基因工程改造 应用前景 Abstract Entomopathogenic fungi can cause exogenous infectious diseases within plenty of insects which vary considerably in their mode of action and virulence During the long profound development history of mankind the attempts to control insects have changed over time from chemicals to natural control methods This is why the development of natural methods of insect control or biopesticides is preferred There is no doubt that insects have been used for many years but their reasonable and effective use in the field remains elusive In this article the biological classification pesticide mechanism and novel genetic research methods were discussed and also current study about virulence present and pesticides production Key words Entomopathogenic fungi biopesticide genetic project improved methods 1 前言前言 昆虫病原真菌是指那些在寄主正常生理条件下能直接侵入体内 增殖和迅速引起死亡的 类群 它们以吸收血淋巴中的养分 分解寄主组织或产生有毒代谢产物而杀死昆虫 在引起 昆虫传染性疾病的致病微生物中 由真菌引起昆虫死亡的情形最多 约占 60 对虫口密 度起着重要作用 被真菌感染后 昆虫虫体能引发一系列病状 如虫体僵硬 取食倾向下降 甚至行为受到真菌操控 从根本上说 侵染成功与否取决于真菌在寄主体壁的粘附和穿透能 力 昆虫病原性真菌产生毒素的过程包含四个步骤 附着 萌发 分化 穿透 它们决定着 最终病原菌的致病性 昆虫体壁降解的同时一系列胞外酶也大量合成 通常粘附时会分泌粘 液 酶 植物凝集素 疏水作用与静电作用也同样重要 能否粘附成功是判断病菌致病性的 标志 粘附成功后 酶解和水解作用将昆虫表皮溶解 比较重要的酶类有脂肪酶 蛋白酶 几丁质酶 酶类随体壁成分的更替有序的分泌 病原菌物从急性致死到完全寄生以各种不同 方式在昆虫体内寄生并诱发病症 它们以寄主生存所需的营养为生 有的甚至对寄主产生致 命性危害 昆虫被感染后进而以流行病方式传播 最终导致种群数量降低 昆虫病原性真菌 的寄主范围十分广泛 包括鳞翅目 幼虫 蚜虫 牧草虫 但只针对特定的寄主 对非靶生 物或益虫的命中率很低 因而在世界范围内被大力推广 昆虫病原性真菌能产生对昆虫致命的毒素 利用该良好特征 不少学者提出生物杀虫的 概念 昆虫病原性真菌与传统的化学杀虫剂相比 在效率与成本方面更占优势 除效率高之 外 应用生物杀虫剂还有很多优越之处 如对人体无毒 专一性强 食品中残留量少 不引 起生态系统中生物多样性的紊乱等 到目前为止 有 13 个种或者亚种的昆虫病原真菌已经 被登记和注册为真菌杀虫剂和真菌杀螨剂 其中大多数成分包括子囊菌中的绿僵菌和白僵 菌 在美国 绿僵菌的成分被商业化 并用于控制甲虫 苍蝇 蚊子 白蚁 蓟马 和扁虱 其他几个国家将绿僵菌的几个菌株开发成生防试剂 并大规模释放 以应对蚱蜢 蝗虫 金 龟子 沫蝉 蛴螬和蛀虫 由于目前昆虫病原性真菌在杀虫方面的使用率仍不及化学杀虫剂 因而其商业发展也受 到了一定限制 我们已经证实在绿僵菌中编码节肢动物神经毒素的基因的表达能加强病菌的 毒力 我们也培育出了一种能合成单链抗体片段的绿僵菌菌株 它能阻止疟疾的传播 重组 抗体提供了一大批潜在的抗昆虫效应物 这些效应物与亲本野生型菌株相比具有高度专一的 生物杀虫结构 且能将对环境的负面影响降至最低 2 分类分类 真菌是最常见的昆虫病原菌 十分适用于生物杀虫剂的制造 至少 90 个属 700 个种 以上的真菌是昆虫病原性真菌 除高等担子菌外 其余病原性真菌菌分散于各个主要的真菌 分类学科目中 昆虫病原真菌约占昆虫病原微生物种类的 60 以上 主要集中在藻菌纲 子囊菌纲和半知菌类的真菌中 其中数量最多 最重要的是藻菌纲的虫霉目和半知菌类的丛 梗孢目 1890 年 美国第一次用白僵菌防治麦长蝽 至今已有一百多年的历史 此后许多 国家如日本 前苏联 巴西 英国等也开始应用白僵菌 绿僵菌 黄僵菌等防治农林害虫 目前在昆虫病原真菌中 研究最多的是白僵菌 其次是绿僵菌 拟青霉 曲霉菌 虫霉菌 菜氏蛾霉 汤氏多毛菌 赤霉菌和虫生藻菌等 2 1 白僵菌 白僵菌是发展历史较早 普及面积大 应用最广的一种昆虫病原真菌 属半知菌类 主 要用于防治玉米螟和松毛虫 其寄主种类达 15 个目 149 个科 521 个属 707 个种 还可寄生 13 种螨类 白僵菌不仅田间残效长 而且在越冬期仍有 36 55 幼虫被寄生 以致来年不能 羽化 这样 连年使用可大大降低虫量 这是其它药剂所不能比拟的 据资料报道 在前苏 联主要用它防治马铃薯甲虫 美国用于防治森林害虫 而我国用它防治的害虫种类达 40 种 以上 其防效在 80 以上 2 2 绿僵菌 绿僵菌是最早用于防治农业害虫的真菌 属于半知菌类 能寄生昆虫的 8 个目 30 个 科约 200 多种 也能寄生螨类 可诱发昆虫产生绿僵病 目前 我国已有绿僵菌杀虫剂工业 化生产 产品产孢量 50 亿个 g 萌发率 91 用含孢量 2 亿 ml 绿僵菌粉防治杨天牛 防效 可达 70 以上 3 4 中国农科院生防所用绿僵菌防治东亚飞蝗 室内处理后第 10d 死亡率 为 100 并在 1995 年进行了田间试验 取得了较好效果 初步证明应用绿僵菌防治东亚 飞蝗有很好的前景 樊美珍等用其防治柑桔吉丁虫也获得成功 2 3 拟青霉 我国大田应用的拟青霉主要有淡紫拟青霉 粉质拟青霉和肉色拟青霉等 淡紫拟青霉主 要用于防治大豆胞囊线虫和烟草根结线虫 其杀虫活性较高 发酵液有类似细胞分裂素的作 用 可促进作物生长 目前 我国已进行工业化液体发酵生产 主要用于防治大豆胞囊线虫 病 防效在 60 以上 2 4 曲霉属 曲霉属是一类分布广泛的真菌 它能生活在各种基物上 其中有一些种类与昆虫有密切 的关系 已报道的可寄生昆虫的曲霉菌资源有黄曲霉 黑曲霉 亮白曲霉 青霉状曲霉 日 本曲霉 寄生曲霉 白曲霉 灰绿曲霉和四脊裸胞壳等 其中 黄曲霉寄生甘蔗白螟 自然 寄生率为 6 8 人工感染致死率达 70 75 四脊裸胞壳对蚜虫有很高的寄生率 2 5 其他 包括座壳孢菌 多毛菌 虫霉 镰刀菌在内的其他病原性真菌也同样广泛施用于田间用 于不同种类病虫害的防治 如 双座壳孢菌可防治剌棉蚧 将有粉虱座壳孢子座的柑桔枝叶 挂在桔园中 防治柑桔粉虱寄生率达 70 90 以汤氏多毛菌对柑桔锈瘿螨 柑桔锈壁虱 柑桔全瓜螨 防效可达 70 90 3 真菌毒力的发挥及杀虫机制真菌毒力的发挥及杀虫机制 有关昆虫病原真菌致病相关基因的研究报道很多 病原真菌的致病机理极其复杂 已有 的研究表明 成百上千的基因可能与致病相关 并且致病相关基因的表达受不同侵染阶段昆 虫病原真菌与外界环境或寄主环境互作的调控 3 1 粘附与识别 昆虫病原真菌的侵染孢子主动弹射或随水流 气流被动转运 附着在寄主的表皮上 真 菌孢子对寄主的粘附与识别可能与昆虫体表结构和成分 真菌孢子表面结构和成分有密切关 系 早在 1988 年 Boucias 等就从球孢白僵菌和金龟子绿僵菌孢中分离到与孢子附着有关的 糖蛋白类 真菌在粘附时通常会分泌粘液 酶 植物凝集素 当然 疏水作用与静电作用也 同样重要 能否粘附成功是判断病菌致病性的标志 粘附过后 酶解和水解作用将昆虫表皮 溶解 比较重要的酶类有脂肪酶 蛋白酶 几丁质酶 酶类随体壁成分的更替有序的分泌 Wang 和 Stleger 研究了金龟子绿僵菌孢子的粘着蛋白 MAD1 和 MAD2 证明粘着蛋白 MAD1 是诱导产生的 在增加附着力的同时 调控 septin 等细胞周期调控有关基因的表达 影响孢 子萌发和菌丝发育 为多功能蛋白 MAD 的缺失推迟孢子的萌发和入侵昆虫后血腔中芽生 孢子的形成 降低真菌毒力 而 MAD2 与孢子粘附植物表面有关 缺失后阻碍对植物的粘 附 不影响对寄主昆虫的识别和真菌的致病力 由于昆虫和植物有不同的表面结构和成分 这表明 真菌对昆虫和植物具有特异的识别机制 3 2 萌发与穿透 昆虫病原真菌一般从昆虫表皮侵入 侵染结构也就必不可少 观察到的特殊的侵染结构 包括附着胞 穿透钉 穿透板 穿透菌丝等 昆虫体表的水分 离子 脂肪酸和营养成分等 因素影响着孢子的萌发与行为 其中 蛋白酶的活力是影响真菌侵染力的重要因素 目前已 经鉴定了许多真菌水解酶 昆虫病原真菌侵染寄主时产生的蛋白酶可分为外切和内切蛋白酶 两大类 内切蛋白酶主要有金属蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 类枯草杆菌蛋白酶及胶原蛋白酶 外切蛋白酶主要有羧肽酶及氨肽酶 不同的病原真菌产生的蛋白酶在种类和数量上有所不 同 萌发要求能吸收可利用的营养成分 且对体表的有毒化合物有一定抵抗能力 萌发后 芽管的末端或一端出现附着胞 呈膨大球形的结构或膨大的菌丝体结构 一段时间后 附着 胞上会形成侵入寄主体内的侵染钉或穿透钉或穿透菌丝等结构 菌丝扩展也可以形成穿透 板 真菌从此处进入寄主体内 3 3 体内增值 昆虫病原真菌在寄主体内繁殖 必须利用寄主的营养 这会造成寄主昆虫衰竭死亡 昆 虫中广泛存在一种贮存非还原性二糖 海藻糖 是血淋巴中最主要的糖源 约占 80 90 海藻糖对昆虫有重要的生理作用 Xia 等研究表明 绿僵菌侵入寄主血淋巴后 分泌海藻糖 酶和酸性磷酸酶 降解海藻糖和有机磷等 产生小分子葡萄糖和游离磷酸 为绿僵菌生长繁 殖提供碳 磷营养 从而导致寄主昆虫减少取食 活动变缓 最后衰竭死亡 4 基因研究手段 基因研究手段 利用基因改良剂改造的方式 我们成功将昆虫病原性真菌的利用价值发挥出来 为人类 的生活提供便利 以绿僵菌为例 正如无性型药用菌冬虫夏草一样 绿僵菌在作用于昆虫 真菌 细菌 病毒和癌细胞是能大量合成酶 各种次生代谢产物 另外 绿僵菌所产生的酶 类也常在工业上用作催化剂 用比较基因组学的方法对广谱绿僵菌和对蝗虫专一的绿僵菌的 试验证实 绿僵菌分泌的蛋白远比植物病原菌 非植物病原菌要多 可见绿僵菌与其生存环 境之间的关系十分复杂 正如所期待的那样 许多分泌后的蛋白为同一家系 且参与昆虫组 织的定植 如蛋白酶 绿僵菌中有 32 个基因可调控蛋白酶的合成 而其中以胰蛋白酶系的 酶居多 这一数量几乎是蝗虫专一性绿僵菌的两倍 其他真菌的 6 10 倍 总体来说 在植 物的利用方面 绿僵菌比其他植物病原菌的可用基因少 但几乎所有的植物细胞壁水解酶家 族都能在该基因组中出现 甚至连里式木霉这样的腐生菌都缺少降解植物细胞壁的家族酶 系 而该家族酶系能在绿僵菌中出现表明这些物种可以利用活体植物组织 推测有助于菌类 在根部表皮定植 绿僵菌的生活方式多种多样 代谢途径也不拘一格 因此可在各种环境中 得以生存 它们可以在营养并不充足 甚至存在对其他真菌来说致命的化合物也可以照样生 存 正如所设想的那样 绿僵菌的基因组合有相对较多的与去毒相关的基因 但与蝗虫专一 性绿僵菌 甚至是镰刀酶相比 广谱寄生绿僵菌能产生更多的次生代谢物 在绿僵菌中 许 多表达毒力的基因都有独特的复制机制 但使用基因芯片对比基因时发现绿僵菌中有关毒力 扩散和消失的基因仅对甲壳虫和蟋蟀有专一性 我们也曾经利用 EST 手段 基因芯片分析及高产量转录技术将昆虫的核心与根围的绿 僵菌 2575 型诱变菌株副本相联系 提出一套有关植物 菌物 昆虫的相互作用理论机制 在 侵染昆虫寄主早期 所有的绿僵菌菌种都有约 20 的基因处于高水平表达状态 通过对致 病性 毒力和效应基因的实验 证实了其他真菌 特别是相关的植物病原菌 与绿僵菌有相 似的基因序列 这就需要多种信号传导的元件来为绿僵菌建立十分复杂精微的分子结构 以 此来调整细胞的分化 应对不同的昆虫寄主 绿僵菌与真菌寄生生物类似 都能使翻译 译 后修饰 氨基酸与脂肪代谢处于上调水平 这三种菌侵染结构的构造都与氮被剥夺和相关压 力作用管辖的基因水平上调有关 这可能是所有真菌最基本的共同之处或寄主的外部表皮特 征所引起的 植物 昆虫外表均被坚硬 蜡质的表皮覆盖 基因芯片有关研究证实了绿僵 菌能形成多种不同的表达途径 以此来适应各种不同的生活环境 土壤 水域 根部分泌液 昆虫体表和血淋巴 绿僵菌菌株的一些高水平表达基因的构造及功效已被识别 其中一些基因能编码如蛋白 激酶 A 一类的调节物质 它能控制许多毒素分泌方面的表达 还有能控制菌丝伸入血腔的 渗透感受器 能调节脂类分解 渗透压和侵染结构构造的脂滴包被蛋白 一些基因高度适应 了绿僵菌的特殊需求 其胶原结构域迄今为止绝无仅有 从绿僵菌中也分离出了粘附素 能 分别完成昆虫体壁及植物表皮的粘附 有一点极其重要 绿僵菌能分别正向调节对植物和昆 虫体壁的特定粘附 证明有特定的基因调控其双重的生活方式 其他定植根围所需的基因包 括 一种新型的转运根部营养的低聚糖转运体 特别是棉子糖 还有一种 RNA 结合蛋白 它对腐殖性营养与病原性侵染都有至关重要的作用 不论是转运体还是 RNA 结合蛋白 它 们都成为真菌第一重要的良好特征 同时向我们揭示了真菌在土壤中意想不到的生存策略 这无疑是对真菌生物学有着重大意义的 5 基因工程改进的病原菌 基因工程改进的病原菌 在许多发展中国家 植物病原菌物与害虫病原菌物生防试剂的使用已取得一定进展 尤 其是在有政府或国际组织的资助下 活跃于缝隙市场中 例如绿僵菌已在非洲 澳大利亚和 中国投入使用 用于蝗虫的生物防治 但另一方面 真菌市场占有率也受到表达效果不一致 和毒性低 致死缓慢 接种量高 的制约 只占有很小一部分市场 低效性也许是其内在的 无法动摇的一个特征 因为微生物与寄主间的进化平衡导致快速致死 即便是提高接种量而 达到的快速致死效果 对病原菌来说也是极难适应的 目前一些功能性基因的相关知识已被 用作绿僵菌应用于生物防控制剂的改进 基因序列会促进候选基因的识别操纵 以此提高绿 僵菌的应用优势 不仅发挥杀虫功效 同时也可以成为潜在的生物肥料 参与植物病原菌的 拮抗 可开发利用的用于编码对某种物种有专一的毒力的基因还是数量庞大的 在许多昆虫 病原菌中躲避寄主免疫防御的系统可能是独立进化的 所以在其他病原菌中能通过基因重组 在昆虫寄主专一性和毒力的发挥之间建立新的联系 基因工程师们也提供了无数的非真菌案例以提高效力 但也因此牺牲了昆虫病原菌的效 益为代价 节肢动物神经肽的高生物活性的特点尤其引人注目 它能在自然界快速降解 对 环境友好 在绿僵菌中表达的蝎子神经毒素可以缩短 40 的杀虫时间 在毛虫 蚊子和甲 壳虫中的致命孢子的生成量高达之前的 22 倍 尽管节肢动物的毒素对昆虫有严格的选择性 而且蝎子神经毒素已经在美国跨越了田间实施的障碍 但极可能还是有少数国家会迫于对亢 奋性毒素的畏惧而将该项研究扼杀 现有关抗节肢动物毒素的社论有两种不同的说法 一篇 Matthew Thomas 和 Andrew Read 撰写的评论性文章中称赞到 生物杀虫剂对环境友好 副 作用少 且使用助催化剂时也同样安全 直到真菌菌丝遇到靶昆虫体内的血淋巴后才会形成 毒素 因此毒素不会在昆虫体外合成 Bernard Dixon 在文章中使用了一个很有煽动性的标 题 可疑的试验 他指出用以描述一些研究手段的言辞过于激进 不尊重科学 因而为这个 世界平添了许多强烈的不安与焦虑 他也同样赞举了发展这门科学的积极方面的原因 那就 是生物杀虫剂是自然选择的结果 副作用少 更重要的是替代了广谱的神经毒素杀虫剂 近期我们生产了一种能表达单链抗体结构的绿僵菌菌株 它能抑制疟疾的传播 重组基 因抗体也能产生一大批有针对性的抗昆虫效应物 如昆虫激素受体 这使得高效 高度专 一的生物杀虫剂的结构与野生型相比能将对环境的不良影响降至最低 且一些全球作物害虫 及疾病也很易受生物技术的掌控 前人有先例证明 这些问题需要生物转基因技术来解决 协调相关问题的组织协会也表示愿意去解决此类难题 最迫切的需求十分明晰 例如疟疾的 防控 在很大程度上 我们认为现已被广泛认可的技术会随着真菌学的发展而逐步瓦解 疟 疾发病的情况终将减少 而对环境的负面影响也将烟消云散 我们认为 当人们所居住的地 方会产生不良的健康影响时 届时他们极有可能会试着接受这些真菌 毕竟 选择权在他们 自己手中 参考文献参考文献 1 Campbell MA Fitzgerald HA Ronald PC Engineering pathogen resistance in crop plants Transgenic Res 2002 11 599 613 2 Gurr SJ Rushton PJ Engineering plants with increased disease resistance what are we going to express Trends Biotechnol 2005 23 275 82 3 Liu B Zeng Q Yan FM Xu HG Xu CR Effects of transgenic plants on soil microorganisms Plant Soil 2005 271 1 13 4 Punja ZK Recent developments toward achieving fungal disease resistance in transgenic plants Can J Plant Pathol 2006 28 298 308 5 Kiraly L Barnaz B Kiralyz Z Plant resistance to pathogen infection Forms and mechanisms of innate and acquired resistance J Phytopathol 2007 155 385 96 6 Bent AF Mackey D Elicitors effectors and R genes The new paradigm and a lifetime supply of questions Annu Rev Phytopathol 2007 45 399 436 7 Collinge DB Lund OS Thordal Christensen H What are the prospects for genetically engineered disease resistant plants Eur J Plant Pathol 2008 121 217 31 8 Zhao BY Lin XH Poland J Trick H Leach J Hulbert S A maize resistance gene functions against bacterial streak disease in rice Proc Natl Acad Sci USA 2005 102 15383 8 9 Yang SM Gao MQ Xu CW Gao JC Deshpande S Lin SP et al Alfalfa benefits from Medicago truncatula The RCT1 gene fromM truncatulaconfers broad spectrum resistance to anthracnose in alfalfa Proc Natl Acad Sci USA 2008 105 12164 9 10 van der Vossen EAG Gros J Sikkema A Muskens M Wouters D Wolters P et al The Rpi blb2genefromSolanumbulbocastanumisanMi 1genehomologconferring broad spectrum late blight resistance in potato Plant J 2005 44 208 22 11 Zhou YL Xu JL Zhou SC Yu J Xie XW Xu MR et al PyramidingXa23andRxo1for resistance to two bacterial diseases into an elite indica rice variety using molecular approaches Mol Breed 2009 23 279 87 12 Tian D Traw MB Chen JQ Kreitman M Bergelson J Fitness costs of R gene mediated resistance inArabidopsis thaliana Nature 2003 423 74 7 13 Govrin EM Levine A The hypersensitive response facilitates plant infection by the necrotrophic pathogenB