第六章 凝胶过滤-1.ppt

第六章凝胶过滤 凝胶过滤 本章提要 凝胶的分类和性质基本原理凝胶层析操作应用 凝胶过滤 凝胶过滤 gelfiltration 又称分子筛层析 molecularsievechromatography 或排阻层析 原理 凝胶具有内部网状结构 小分子物质能进入其内部 路径长 后跑出层析柱 大分子物质被排阻在外 路径短 先跑出层析柱 这样 不同大小的分子就得到了分离 凝胶过滤 第一节凝胶的分类及性质 1 1葡聚糖凝胶 Sephadex 交联度 交联剂在凝胶中占的百分数 交联度大 孔径小 能分离的分子量小 凝胶过滤 2 排阻极限 不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子量 3 分级范围 能分离的分子量范围 4 吸水量 1g干凝胶所吸收水分的量 如 G 50的吸收量为5 0g 凝胶过滤 5 凝胶颗粒 用筛目表示 100 200目6 稳定性 化学稳定性高 凝胶过滤 1 2琼脂糖凝胶 Sepharose 美国称 Bio gelA英国称 Segavac 凝胶过滤 型号 按琼脂糖的浓度 分为 Sepharose2B 2 Sepharose4B 4 Sepharose6B 6 凝胶过滤 CL 型交联琼脂糖凝胶 Sepharose与1 3 二溴异丙醇在强碱条件下生成 pH应用范围更广 pH3 14 Sepharose CL 4B 可以用作疏水层析介质的基质 凝胶过滤 1 3聚丙烯酰胺凝胶 单体 丙烯酰胺 Arc 交联剂 N N 亚甲基双丙烯酰胺 Bis 凝胶过滤 理化性质 珠状颗粒 用前需溶胀 稳定性好 pH1 10的缓冲液中稳定 凝胶过滤 1 4Sephacryl 由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联而成 可用于分离蛋白质 核酸 多糖 蛋白聚糖等 凝胶过滤 1 5Superdex 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价连接而成 理化性质 稳定性好 pH3 12稳定 良好的分子筛特性 凝胶过滤 第二节基本原理 凝胶过滤介质内部具有立体网状结构 颗粒内部有一定大小的筛孔 凝胶过滤 凝胶床总体积 Vt Vo Vi Vg Vo 凝胶颗粒外水体积 Vi 凝胶颗粒内水体积 Vg 干胶颗粒体积 凝胶过滤 1 分配系数Kav 表征了任何一种物质在凝胶层析中的被排阻程度 Kav Ve Vo Vt Vo Ve 洗脱体积Vt 凝胶床总体积 凝胶过滤 Kav是判断分离效果的一个重要参数 各组分之间Kav差异越大 分离效果越好 凝胶过滤 Kav的测定 Kav Ve Vo Vt Vo Vt的计算 Vt r2h或Vt Vo Vi Vg Vo Vi Vo 外水体积 用蓝色葡聚糖2000 M 200万 测定 Ve Vo Vi 内水体积 用小分子物质 硫酸铵等 测定 Ve Vo Vi 凝胶过滤 第三节凝胶层析操作 3 1凝胶的选择和处理3 1 1凝胶的选择1 型号 根据被分离物分子量大小来确定如 脱盐 用SephadexG 25 凝胶过滤 2 粒度 粗 中粒度 流速快 分辨率低 细粒度 分辨率高 但流速慢 凝胶过滤 3 1 2凝胶用量的计算干胶用量 柱体积 膨胀度 再加10