黑曲霉发酵柠檬酸.doc

黑曲霉发酵生产柠檬酸（中北）生物技术 18083108 陈园园摘要：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤，了解产物提取的几种方法，学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理，掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸实验材料和试剂：样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处）培养基：查氏培养基、马铃薯培养基无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶试剂：400U/mL庆大霉素液、10苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0.1M NaOH 、0.1M H2SO4实验器材：无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱实验步骤一黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养1.黑曲霉的分离培养土壤样品的采集用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取525cm处的土样1025g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。制平板：在融化好的查氏培养基中加入链霉素0.2mL/瓶制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。制备土壤稀释液：1. 称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10苯酚溶液，振荡5min，即为稀释101的土壤悬液。 2. 另取无菌离心管2支，用记号笔编上102、103、104，再加入0.9mL无菌水。取101的土壤稀释液，吸取0.1mL加入第一只离心管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成102土壤稀释液。同法依次连续稀释至103、104土壤稀释液。无菌操作法分别吸取102、103 、104土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的3块查氏平板培养基上。涂板用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，静置于桌面5min。2.黑根霉的分离培养马铃薯培养基2块1号马铃薯培养基用接种环无菌操作从酒酿样品中挑取1环在上面进行划线分离，2号马铃薯培养基取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻璃珠的无菌水三角瓶进行稀释溶解，取稀释液0.1mL在上面进行均匀涂布。将划好的培养基置于517房间30培养箱内正置培养3天，进行结果观察和转接。3.菌种检测和扩培培养72小时后，星期一过来，检查查氏培养基和划线马培，看是否有产酸的曲霉菌落，和典型的根霉菌落，并显微检测其是否为黑曲霉和黑根霉。确证后分别将其转接至剩余的两块PDA平板培养基上扩增培养和保藏。二黑曲霉发酵柠檬酸1.种子液制备菌种获得（纯种），无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上，用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制成孢子悬液。2.液体深层发酵无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇床上，30培养56天。 三柠檬酸的提取把发酵完成后的发酵液中的目的产物提取出来，并通过精制成为合格产品，该过程通常称为后提取，后提取是发酵工程不可缺少的部分。 1、处理黑曲霉玉米粉发酵液：布氏漏斗垫上纱布抽滤除去菌体和残渣，量筒测量清液体积 V0；2、滴定：量取5mL清液、5mL蒸馏水于锥形瓶中，再滴入23d酚酞指示剂，用0.1M NaOH 溶液滴定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，记下消耗的NaOH 溶液体积V1；M总酸（g）V1(mL)0.1(mol/L)0.0011/3210 V0 /5M碳酸钙（g）M柠檬酸（ V0 5）/ V0 1/2103/21003、钙盐沉淀：称取一定质量的碳酸钙粉末，边搅拌边缓慢地加入到剩余的清液中（防止产生大量的泡沫），85反应5min（使柠檬酸钙沉淀下来），趁热抽滤，并用沸水洗涤沉淀物23次（除去残糖、蛋白质等可溶性杂质）；4、酸解：VH2SO4（mL）M碳酸钙/100/0.1(mol/L)1000在沉淀物中加入约两倍体积的蒸馏水，调匀成浆状，量取一定体积0.1M H2SO4溶液，边搅拌边加入到浆液中，85度反应10min，趁热抽滤，获得清亮的酸解液；5、 低压浓缩：将酸解液转入圆底烧瓶中，水浴6070度，真空度0.080.09MPa，浓缩至原体积约1/10；6、冷却结晶：将浓缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约15min，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重m柠檬酸。计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：M总酸（g）/ V发酵液（mL）计算钙盐沉淀法柠檬酸的得率：m柠檬酸（g）/ 原料（g） 实验结果：1.黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养结果黑曲霉菌丛黑褐色，菌丝发达多分枝，顶囊大球形，分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。黑根霉菌落呈黑色灰色菌丝为白色呈絮状，从假根处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成球形的孢子囊。2.柠檬酸的提取结果柠檬酸呈白色结晶粉末V0=125ml V1=7.8mlM总酸（g）V1(mL)0.1(mol/L)0.0011/3210 V0 /5M总酸（g）7.80.10.001132101255=1.365gM碳酸钙（g）M柠檬酸（ V0 5）/ V0 1/2103/2100M碳酸钙（g）1.365110125121032100=0.86gVH2SO4（mL）M碳酸钙/100/0.1(mol/L)1000VH2SO4（mL）0.861000.11000=86 ml计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：M总酸（g）/ 原料（g）黑曲霉发酵柠檬酸的产率=1.36510.0=13.65计算钙盐沉淀法柠檬酸的得率：m柠檬酸（g）/ M总酸（g） 钙盐沉淀法柠檬酸的得率=0.561.365=41讨论：本次实验目的为掌握真菌的分离、培养基本方法；获得黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸；了解产物发酵生产的机理；柠檬酸发酵的发酵条件；掌握发酵过程步骤；了解产物提取的几种方法；学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理；掌握沉淀法提取柠檬酸的方法。1.土壤样品的采集需注意以下因素根据土壤特点1土壤有机质含量和通气状况2.土壤酸碱度和植被状况3地理条件4季节条件根据微生物生理特点采样1.根据微生物营养类型2.根据微生物的生理特性2.柠檬酸合成的代谢调节1、由于锰离子的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+ 浓度升高，促进了EMP途径的畅通。2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。3、在控制Fe2+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶和丙酮酸固定CO反应相平衡，以及柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力。5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。3.柠檬酸发酵的条件：1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖；2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）；3、合适的pH值；4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速250r/