pfu问题集.doc

今天用taq酶将我的目的基因扩出来了，但是相同条件用pfu却没扩出来。目的片段长度1。4kb，pcr程序是，94 5min9430sec5030sec721min30sec30个循环7210min请问该如何改进才能适合pfu的扩增？可能含有uracil污染，uracil会抑制pfu的活性，你可以加用dUTPase试试，或者100倍稀释模板试试见笑，uracil是什么啊？模板浓度高也会影响pfu的活性吗？uracil是脱氧尿嘧啶。会干扰高保真酶的35外切酶的活性，稀释模板的目的是为了稀释其中高保真酶抑制剂的浓度另外taq酶的延伸时间可以按1kb/min，pfu呢？另外，退火温度是不是和taq酶的有所不同啊？pfu比taq的力量稍弱。可试：1. 0.25单位的pfu，在25ul中。2. 减少在94 中的时间；降低延链的温度为68 。94 3min94 15 sec50 15 sec68 1 min 30 sec35 个循环68 5 min延伸时间可能不够吧，有说法，PFU的延伸速率是600bp/min,我 扩2KB片段，要延伸时间4分钟才能出条带。2分钟以下都是非特异的扩增。Pfu酶在扩增kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。但不同公司的酶，或运输保存的差异等，会出现酶效力的变化。我用它扩1.7kb的，12.5ul2分钟35周期，挺好的。pfu的特点 1）保真度最高 2）合成速度最慢，600bp/秒，可据此设计延伸时间 3）扩增片段不长，一般不要超过2kb，如果你要扩的超过2k，建议换酶或分段 4）退火好象没什么特别的 此外，PCR不成功的原因很多，引物有时更重要可以用混合酶，20:1 普通酶和PFU酶。 缓冲液直接用pfu的。pfu的缓冲buffer与一般的Tag酶是不一样的（主要是盐浓度不一样），查查说明书比较一下就知道了。在普通Tag酶的退火温度的基础上提高5度以上，就可以了。 试试吧，如果成功的话，别忘了给我回一个帖子。Pfu的效率最低的，想方便的话，用TAKARA的LA taq 酶，想省钱的在PFU里加点普通Taq酶用RT-PCR产物作为模板？大概是用RT的产物作为模板吧。首先检查一下buffer有没有问题，Pfu有专用的buffer。大于2kb的片段最好不要用Pfu扩增，Pfu扩增长片段不灵。可以用Taq plus(Taq和Pfu的混合物，也很便宜)扩增较长的片段，既兼顾了保真性和扩增效率而且可以用T载体克隆目的片段。你可以用Clontech公司的Advantage cDNA 聚合酶复合物（Advantage cDNA PCR Kit & Polymerase Mix），它具有高效率、高度真实性及能有效扩增长片段DNA等特点，且可以直接作T-A 克隆。要注意4点1.PFU的TM值要比Taq酶低1到2度。2.酶的量要为Taq酶的2到3倍。3.延伸时间稍稍延长。4.采用热启动的方式。理由如下：PFU的扩增效率较低所以要加大酶的量和延长延伸时间，又由于PFU具有3-5的外切酶活性，而这种活性在单链情况下依然有效，所以很有可能将引物切短从而在正常复性温度下不能与模板结合，但是在延伸温度下PFU的延伸效率大于外切效率，故采用hotsart的方式可以有效避免此现象产生！ 酶活性不太好了吧？Pfu酶扩增效率本来就比Taq酶低试试提高Mg离子浓度是一种方法再不行，该换一支酶了 按你的体系再适当增加mg+的量，同时延长循环次数比如35次。pfu最重要的优点就是保真度高，相对普通taq酶而言在扩增效率上没有什么优势，对PCR反应体系及扩增条件要求较高。对于扩增2kb DNA来说，我认为可以不用pfu，宝公司的LA具有3外切活性，有一定保真度。以前我做RT-PCR扩增3kb片段，开始用EX，死活扩不出来，换了LA以后，同样的条件，一把就出来了，经过大量测序证明，2-3kb根本就没什么变异。如果模板质量不好或者量很少的话，LA还是很有优势的。我要扩增2kb的DNA，买了鼎国的高纯度pfu（/l）。想请教有没有那位大侠用过，采用什么样的体系比较好呢？谢谢。 pfu就是高保真性DNA聚合酶，使用上与一般Taq酶没有多大区别。我没用过鼎国的pfu酶，但是用过promega的，觉得它的专一性还可以，但是扩增产物浓度不高。体系如下：10Xbuffer 5uldDTP（各2.5mM） 4ul引物1（10um） 2ul引物2（10um） 2ul模板DNA（100-300ng/ul） 1ulpfu 0.25ul加水至 50ul用taq plus大概比例是taq/pfu=4:1当taqpfu酶 混合成taq plus 酶 时 用的taq：pfu 的比例通常为10：1。TAKARA pyrobest 保真性相当于pfu,扩增4-5kb LA taq，保真性高于Taq,低于pyrobest,扩增10kb 扩增能力是我们验证过的，保真性也没出过问题 这些酶比其他进口酶便宜pyrobest扩增3kb没扩出来 LA Taq保真性实在是太差，最近扩1-3kb的东西都出现错误，做表达实在是勉强pyrobest 我们还没有测到过突变，曾经成功扩增4-5kb ，但也有2-3kb扩增失败的例子，但这种酶的产量和扩增能力确实不错。影响PCR的因素很多，长片段扩增对反应条件要求更苛刻。 LA taq扩增的东西我们没有测过序，但这种酶的产量和特异性不错。1） pfu，保真性最高的高温聚合酶，产量低，扩增片段小（2KB以内），国产的价格低（7-8毛钱/单位，也许还有更便宜的） 2）pyrobest，大连Takara的特色产品，据说（公司说的）保真性等于pfu，但