基因的重组与转移.ppt

外源DNA 载体DNA 重组分子 原核细胞 真核细胞 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 受体细胞 第六章基因的重组与转移 一 粘性末端的连接 第一节DNA片段的体外连接 一 同一种酶产生的黏性末端的连接 二 不同种酶产生的黏性末端的连接 二 齐平末端 bluntend 的连接 5 端与3 端并列靠近的时间太短 不容易被连接酶连接 1 直接连接 T4DNA连接酶虽然能连接平末端 但效率很低 只有粘性末端的1 5 5 5 5 3 3 3 3 OH OH P P P P HO HO 5 3 OH P P HO 5 3 1972年 斯坦福大学的P Labban和P Kaiser提出 1 同聚加尾法 2 人工加尾形成 粘性末端 DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3 OH端加上脱氧核苷酸 原理 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸 加尾 碱基互补 缺点 优点 能把任何片段连接起来 不能把插入片段再切下来 非酶切位点 用T4DNA连接酶连到平端DNA上 然后再用酶切 形成一个人工粘性末端 2 衔接物 linker 连接 linker 用化学合成法合成的一段10 12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链 GGAATTCCCCTTAAGG EcoRIlinker linker的作用 缺点 1 可以用内切酶把插入片段切下来 如果插入片段内部也有该酶位点 不能切下完整的插入片段 2 能给载体连接上Polylinker 优点 3 DNA接头 adapter 连接法 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明 5 p GATCCCGG OH3 GGCC p5 BamHIadapter 用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端 直接成为人工粘性末端 adapter 一头平末端 另一头粘性末端 某种酶切位点序列 adapter的作用 Blunt endedDNA 5 p GATCCCGG OH3 HO GGCC p5 BamHIadapter P P 5 p GATCCCGG GGCC CCGG GGCCCTAG P5 5 p GATCCCGG GGCC CCGGGGCCCTAG P5 CCGGGATCCCGG OHGGCCCTAGGGCC P5 接头自我连接 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起 影响与DNA片段的连接 优点 连上后就能用 缺点 先用小牛肠碱性磷酸酶 CIP 处理接头 水解掉其5 端的磷酸 防止自我连接 以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸 防止自我连接 5 p GATCCCGG OHHO GGCC P P CCGG OHHO GGCCCTAG P5 CCGGGATCCCGG OHHO GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接 5 GATCCCGG OHHO GGCC5 5 CCGG OHHO GGCCCTAG5 CIP处理 OH HO Blunt endedDNA 5 p GATCCCGG OH3 HO GGCC p5 BamHIadapter P P 5 GATCCCGG HO GGCC CCGG OH GGCCCTAG5 5 GATCCCGG OH3 HO GGCC5 缺口 缺口 HO OH CIP处理 T4ligase 虽然有缺口 但仍然能与DNA片断连接 三 PCR产物的连接 1 在引物的5 端设计酶切位点 符合载体的多克隆位点 1 设计原则 2 带酶切位点的引物的结构 3 端15 20bp与模板互补 5 端6 10bp是某个内切酶的识别序列 5 端多余的3 5bp属保护碱基 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复 引物1 GCAGAATTC 互补序列 模板 EcoRI位点 5 3 GCAGAATTC 互补序列 5 3 3 模板 GCAGAATTC 互补序列PCR产物 5 3 3 复性 延伸 模板 模板 3 3 GCTAGCCGG 互补序列 模板 BamHI位点 5 3 5 复性 延伸 模板 模板 3 3 GCTAGCCGG 互补序列 5 3 模板 5 GCTAGCCGG PCR产物互补序列 5 3 引物2 带酶切位点的PCR产物 GCAGAATTC PCR产物 5 3 GCTAGCCGG PCR产物 5 3 CGTCTTAAG CGATCGGCC EcoRI位点 BamHI位点 AATTC PCR产物 5 3 GCTAG PCR产物 5 3 G C EcoRI BamHI 两头各有一个粘性末端 2 与T载体直接连接 1 PCR产物两个3 端一般都有一个A TaqDNA聚合酶的特性 在DNA双链的3 端再加上一个多余的核苷酸 优先加A 2 T载体的两个3 端人为地各加一个T 利用TaqDNA聚合酶 当原料中只有dTTP时 被迫在平端载体上添加T A A dNTP T T dTTP TaqDNA聚合酶 载体 PCR产物 TA TA 四 DNA体外连接应注意的事项 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接 尽量避免平端连接 决不能进行非粘性末端连接 EcoRI EcoRI EcoRI 1 用相同的酶切 2 用同尾酶切 BamHI BclI BglII Sau3AI XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端 2 DNA插入的方向正确 用双酶切 由于产生的粘性末端不同 只能以固定方向连接 EcoRI BamHI EcoRI BamHI EcoRI BamHI 3 插入基因的开放阅读框 ORF 正确 1 DNA定向插入 2 起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候 更要注意 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATGGAATTCT 重组 但移码突变 4 防止载体自身环化连接 1 提高插入片断的用量 连接反应体系中 插入片断比载体多10倍以上 2 用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5 磷酸被除去 不能自我连接 但可以与插入片断以单链连接 5 3 载体 插入片断 1 载体自身环化连接 能存活 2 载体之间互相连接 能存活 3 插入片段互相连接 不能存活 4 一个载体与几个插入片段重组 能存活 五 载体和外源DNA插入片段的连接结果 5 几个载体与一个插入片段重组 能存活 1 目的 增加受体菌细胞膜的通透性 第二节重组体导入细菌细胞 一 感受态大肠杆菌的制备 使用丧失了限制体系的大肠杆菌 如K12系列的大肠杆菌 2 菌种 用CaCl2处理大肠杆菌 能增加膜的通透性 3 制备原理 4 制备过程 培养大肠杆菌 OD600至0 3 0 4 Onice5 10min 4 离心收集菌 用冰冷的60mMCaCl2重悬 4 离心收集菌 4 离心收集菌 分装 70 冻存 用冰冷的60mMCaCl2重悬 Onice30min 用冰冷的60mMCaCl2重悬 二 重组DNA导入大肠杆菌 1 转化 transformation 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程 2 转染 transfection 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程 1 外源DNA导入细菌的几种方法 3 转导 transduction 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程 3 转化方法 2 转化率 简单 但转化效率不高 106 108 gDNA 1 热休克法 heatshock 转化效率高 高于109 gDNA 2 电转化法 转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率 有两种表示方式 一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示 二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示 用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示 难以反映分子大小与转化率之间的关系 10ng载体DNA 100 L感受态菌 Onice混合 静置10分钟 42 C1分钟 加入1mLLB培养基 37 摇1小时 10 100 L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA 1 热休克法 LB培养受体菌至OD600 0 5 0 6 冰浴15分钟 2 C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2 C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2 C离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成50 300 L 电转仪调为2 5kV 25 F 脉冲控制器200 400 0 5 g质粒DNA Onice混合 加入1mLSOC培养液 37 C中速震荡60分钟 10 100 L转化液涂含抗菌素的平板 转化 2 电转化法 4 平板培养基培养细菌 10 100 L转化液 涂于含抗菌素的平板 37 过夜 5 影响转化率的因素 1 分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高 分子质量较大的重组质粒DNA分子转化率较低 对于大于15kb的重组质粒则很难进行转化 2 组成重组DNA分子的载体类型及其构型 与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体 而处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构 成线性结构的质粒载体有更高的转化率 3 重组DNA分子的浓度和纯度 在10ng 100u1以下的DNA浓度范围内 转化效率与DNA分子数成正比关系 生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌 必须在冰冷的条件下制备 要充分 使细菌细胞膜失去一些蛋白 储存感受态菌要在 70 以下 CaCl2处理 使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用 4 感受态细胞 competentcells 把重组的噬菌体 DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的 噬菌体颗粒 6 体外包装的噬菌体的转导 1 体外包装 invitropackaging 2 转导 transduction 通过受体菌细胞表面的 DNA接受器位点 receptorsite 使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增 cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因 感染细菌后 在32 下培养细菌时能够保持溶源性 但当温度升高到44 45 时 就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活 DNA复制 外壳蛋白合成 便于提取外壳蛋白 3 cI857基因突变的 噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变 所以细菌还不裂解 cI857 其它基因 溶源状态 DNA不转录 不翻译 DNA 阻遏蛋白 阻遏蛋白 44 45 DNA转录 翻译合成外壳蛋白 32 噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变 不能合成头部蛋白 但能合成其它外壳蛋白 尾部蛋白 在cI857基因突变的 噬菌体的基础上 选择两种外壳蛋白的突变型 噬菌体 4 互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变 不能合成头部的包装识别蛋白 但能合成其它外壳蛋白 头部 尾部蛋白 噬菌体2 5 体外包装过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌 使受体菌发生溶菌 形成噬菌斑 每 g DNA能形成106噬菌斑 6 转导 转化率高的菌株 有突变的菌株 与导入的载体基因互补 不育的菌株 不会与其他酵母接合 第三节外源基因导入真核细胞 一 导入酵母细胞 1 菌株选择 如 ura3 52 trp1 289 leu2 3 leu2 112 his3 1 1 利用原生质球进行转化 2 酵母的转化方法 酵母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2 PEG 插入外源基因的酵母载体 PEG 聚乙二醇 使细胞壁具有通透性 允许DNA进入 CaCl2使细胞膜具有通透性 允许DNA进入 转化 酵母 0 1mol LLiCl处理 插入外源基因的酵母载体 感受态 40 PEG4000 2 利用Li 盐进行转化 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 DNA直接转移法 二 导入植物细胞 1 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体 一般从以下几个方面选择合适的转化外植体 优先考虑叶片 子叶 胚轴等材料 幼年期外植体 转化的外植体易培养 并有较强的再生能力 注意易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及其数量 外植体的农杆菌接种 把农杆菌接种到外植体的损伤切面 方法 将切成小块的外植体浸泡在准备好的工程菌液中 浸泡一定时间后 转至无菌的吸水纸上 吸干外植体非伤口面的菌液 再进行共培养 将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上 随着外植体的细胞分裂和生长 农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长 故该培养过程称之为农杆菌与外植体的共培养 在此期间完成农杆菌的附着浸染 T DNA的转移及整合 脱菌培养把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长 达到抑制和杀死农杆菌 头孢霉素脱菌培养时间 一般需5 6次继代培养 甚至一直到试管苗形成 另外 还需将外植体转移至筛选培养基上继续培养 筛选出被转化的细胞 经再分化培养成再生植株 几种常用的农杆菌Ti质粒转化方法 叶盘转化法植株接种共转化法植物愈伤组织共培养转化法原生质体共培养转化法植物悬浮细胞培养转化法 叶盘法转化植物细胞 Leafdishtransformation由Horsch等于1985年发展起来的一种转化方法 叶盘法操作程序 叶片表面除菌打孔器制备圆形叶片 即叶盘叶盘于农杆菌液浸泡数秒钟叶盘平铺培养平皿滤纸培养2天筛选长芽培养基进行筛选与再生培养生根培养基上诱导幼芽生根小植株移栽在土壤中 植物原生质体的再生程序 2 DNA的直接转移法 物理方法 电穿孔法基因枪法显微注射法超声波介导转化法激光微束穿孔法 化学方法 多聚物介导法脂质体介导法 生物方法 花粉管通道法 原理 细胞生物学研究证明 细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容 其静膜电位 Vm 约为l00mV 导电性很差 当把细胞置于外加电场中时 会使膜电位升高 双分子层两端电压形成差势 随着外加电场电压升高 细胞膜被压缩变薄 当膜电压升到一定数值时 膜被击穿 可逆击穿 击穿小孔可在一定时间内复原 不可逆击穿 击穿小孔不可修复 处理细胞成活率低 电穿孔法 electroporation 植物细胞 原生质体 纤维素酶和果胶酶 DNA 混合入电击缓冲液 1 2kV 3 25 F电击 愈伤组织 幼苗 分化 又称高速微型子弹射击法 High velocitymicroprojectiles DNA 1 2 m钨弹头 吸附 特制手枪 射击植物 装入 基因枪法 genegun 基因枪法的特点 2 受体广泛 3 操作简单 1 转化效率高 指在显微镜下 将DNA由细胞玻璃针直接注入细胞 可以将DNA直接注入核内而减少溶酶体对外源DNA的降解 有助于基因的整合与表达 适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞 包括原代及传代细胞 胚胎细胞等 显微注射法 microinjection 超声波介导转化法利用低音强脉冲超声波的物理作用 可逆性地击穿细胞膜并形成膜通道 使外源DNA进入细胞 激光微束穿孔转化法 化学法 多聚物介导法多聚物 如聚乙二醇 多聚赖氨酸 多聚鸟氨酸等 和二价阳离子 如Mg2 Ca2 Mn2 与DNA混合 能在原生质体表面形成沉淀颗粒 通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内 脂质体 lipofectin 载体法 脂类包埋DNA 通过细胞膜进入细胞 花粉管通道法把外源DNA涂于授粉的枝头上 使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊 转化还不具有正常细胞壁的卵 合子及早期的胚胎细胞 三 导入哺乳动物细胞 病毒颗粒转染法磷酸钙转导法聚阳离子 DMSO转染法脂质体介导法电穿孔法显微注射技术 生物法 病毒颗粒转导法带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞 然后整合到染色体上 带有目的基