纯化系统（AutoPurification System）.ppt

纯化系统 AutoPurificationSystem 制备色谱简介 2 一 色谱发展和制备色谱分类二 制备色谱基本理论三 制备型高效液相色谱四 Waters纯化系统操作规程五 应用实例 3 一 色谱发展和制备色谱分类 4 1980s 1950s 1903 色谱发展史 1938 茨维特 一种新型的吸附现象及其在生化分析中的应用 Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6获得了1938年的诺贝尔化学奖 1940s 1941年 Martin和Synge提出液液分配色谱法 塔板理论1942年 Martin等发展了纸色谱 1952年 Martin和James提出气液分配色谱法 诺贝尔奖1956年 VanDeemter色谱速率理论 用于气相色谱1958年 Golay提出毛细管柱气相色谱 1962年 Klesper提出超临界流体色谱1963年 Giddings奠定了现代液相色谱理论基础60年代中后期 逆流色谱 凝胶渗透色谱 亲和色谱1969年 现代液相色谱受到重视 高速逆流色谱出现毛细管电泳发展 2000s 超高效液相色谱多维分离联用技术 5 模拟移动床色谱 高速逆流色谱 高压制备色谱 低压及中压制备色谱 经典柱色谱 制备薄层色谱 制备色谱分类 吸附柱色谱 离子交换色谱 凝胶柱色谱 亲和柱色谱 干柱色谱 分配柱色谱 低压 0 5Mpa中压 0 5 2Mpa 固定相不需要载体制备型分离重点两相溶剂系统的选择 石油工业和糖工业尤适用于两组分混合物分离 6 二 制备色谱基础理论 7 分析和制备有什么异同 制备方法中关注的参数有哪些 如何选择制备柱的尺寸 如何做到分析到制备的线性放大 制备中难点有哪些 8 9 色谱的基本理论及有关参数 两大理论 塔板理论 阐明了色谱 蒸馏和萃取之间的相似性 将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成 相似于精馏过程 色谱分离也是一个分配平衡过程 N 16 tR wb 2N 5 54 tR w1 2 2速率理论 研究各种动力学因素对峰展宽的影响 H A B u Cu 10 相关参数 分离度 分辨率 在色谱分离过程中表示两组分相互分离的程度 一般情况下 分离度大于1 5时称为完全分离 11 只有峰窄而间距大的分离度是令人满意的 在色谱分析中要求 两组分的保留值差别要足够大两色谱峰要足够窄待测组分的分离度要足够大 分离过程要尽可能短 相关参数 理论塔板数 N 描述色谱峰谱带展宽的程度 是物理因素 N 16 tR W 2选择因子 描述两个被分离组份分离的好坏程度 是化学因素 tR2 tR1 容量因子 k 表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 k tR t0 t0 12 分离因子 柱效 容量因子对分离的影响 相关参数 13 上样量 Capacity 纯化过程中 目标物质的上样量 可以是体积也可以是质量 回收率 Recovery 产品贵重时此项很重要 流动相的条件 环境会影响它 分离度 Resolution 在纯化的最后阶段 此项很关键 尤其是杂质的结构和目的物结构相似时 14 相关参数 15 制备规模 16 分析放大到制备 17 分析放大到制备 确定样品信息 样品性质组成 基体 复杂性 性质 相态 浓度 价值 产品纯度微量天然产物 70 核磁或者红外测试的样品 95 以上定量分析用的标准品 99 以上 18 分析放大到制备 开发分析级分离方法 良好的分离选择性 足够的柱效N合适的溶剂强度 容量因子k 19 分析放大到制备 增加进样量 过载 体积过载 制备色谱上样量应控制在组分峰的容量因子下降10 左右 流动相中溶液浓度 质量过载 20 分析放大到制备 放大为制备级方法 上样量 流速 梯度坡度 S constant Changein organicVm VolumeofthecolumntG GradienttimeF Flow 21 分析放大到制备 测定纯度 除去组分中的溶剂 氮吹 旋蒸 冷冻干燥纯度 HPLC TCL 回收率 重量 活性 22 制备中的难点 相互制约的 三角形 23 制备中的难点 上样量 选择的流动相好的分离度 较高的溶解度进样体积增大至最大进样体积了解样品的性质如对离子型样品改变pH或者缓冲盐的浓度改变溶解样品的溶剂如甲醇 DMSO等 前提保证分离度 温度 待分离成分呈单一主峰不易分开的两组分目的组分含量少 24 制备中的难点 分离度 待分离成分呈单一主峰 25 目的组分含量少 26 样品量对主峰前面微量组分峰宽的影响 样品量对主峰前面微量组分峰宽的影响 不易分开的两组分 27 28 三 纯化系统 Autopurification 29 输液系统进样系统色谱柱检测系统馏分收集系统数据处理系统 纯化系统 30 输液系统 单向阀 A B 过滤器 31 输液系统 单向阀故障单向阀堵死 液体不出来 压力无显示单向阀被污染 压力波动大处理方法 纯水超声10min 甲醇超声15min 过滤器故障过滤器堵塞 压力升高处理方法 纯水超声10min 甲醇超声15min 32 进样系统 33 色谱柱 34 检测系统 紫外检测器蒸发光散射检测器质谱检测器 35 馏分收集系统 UVFractionManager Waters2767SampleManager WatersAutoPurificationSystem操作规程 操作程序 开机 首先准备新鲜流动相 洗针溶液和洗泵溶液T1为弱洗 与初始流动相条件相同 T2为强洗 样品溶解度较好的溶剂 sealwash 10 MeOH 90 H2O 打开计算机电源 进入windows操作系统打开检测器 2767 2545BSM 515泵等待仪器通过自检后在打开Masslynx软件 登录Masslynxv4 1软件 进入运行样品界面 点击Fractionlynx CollectionControl 将Fractionlynx激活 设置收集位置 新建Project File ProjectWizard Yes 输入Project名称 建每个使用人员用个人的名称 Description 可根据需要选择是否填写 点击 next 如已建Project 则打开自己的Project Flie OpenProject Yes 制备常用的Samplelist Samplelist各参数含义 编辑samplelist 从该表格中选出需要的参数 保存samplelist InletFile 在InletFile方法框中任选一方法 点击鼠标右键 选择 edit InletMethod Inlet Inlet 选择溶剂 A1 B1或A2 B2 编辑梯度方法设置压力限制 pressurelimits 设置运行时间 runtime Autosampler 选择进样口 分析或制备选择进样方式 Particallooporfullloop选择是否将样品打入定量环中央选择洗针方式Aferinjectororaftercollection Detector 选择扫描波长注意运行时间和液相时间一致 保存InletFile InletFile的调用 进样位置设置 bottle 编辑FractionFile 右键 edit General FractionDectectionFraction 可选择on或offPeak 峰的类型analysis或preparativeMultipleFractionsMax Fractionsper 最大收集组分数Max Tubesper 最大收集管数RinseBetweenFractions Rinsetime 收集口清洗时间 0 10s Timing SolventFrontDelay 如果想忽略前面的溶剂峰 可设置一个solventfrontdelaytime 0to6000seconds Split CollectorDelay 延迟时间 需要测定 不同的流速有不同的延迟时间 MinimumFraction 最小组分宽度Time 0to300secondsVolume 0to1000mLor0to1000tubesRecommendation 3secondsMaximumFraction 最大组分宽度Time 0to600seconds dependentonchromatography Volume 0to100mLVolume tubes MaximumTubeFill 试管体积百分数0to100 MumberofFractionsto UV Min IntensityThreshold 最小阈值Max Intensity 最大阈值Peakstart UseMITOnly 根据上面设的阈值LeadingEdgeGradient Specifytheminimumgradientrequiredtostartfractioncollectionbyspecifyingoneofthesevalues 50 1 5times100 2 0times200 3 0timesPeakstart BelowGradient 0 100 UseMaxFractionWidth UseMITonly TrailingValley Totriggerpeakterminationbasedonadownwardslope enteravaluelessthan0 Totriggerterminationclosetothevalley enter0 Totriggerpeakterminationbasedonanupwardslope enteravaluegreaterthan0 Timedevents Disable EnableCollect Anypeaksdetectedafterdisablingfractioncollectionandbeforeenablingcollectionarenotcollected Atthestartofarun collectionisalwaysenabled 与前面设置的阈值相关 只有达到阈值才收集Start StopCollect 跟时间有关跟前面的阈值无关UVMIT 阈值的时间事件 保存FractionlynxMethod FractionTrigger1 2 选择需要按照何种模式触发收集 在FractionTrigger中双击可以进行选择WavelengthA B 选择需要检测的波长