水产微生物设计实验.doc

图11 革兰氏染色法1.1原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。1.2步骤革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。2芽孢染色步骤（1）取二支洁净的小试管，分别加入0.2ml无菌水，再往一管中加入1-2接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入1-2接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成浓厚的菌悬液。 （2）在菌悬液中分别加入0.2ml苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热35分钟。 （3）用接种环分别取上述混合液23环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95乙醇冲洗至无红色液流出。 （4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。 （5）取12接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然干燥后，油镜观察，在淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。3.甲基红实验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于361或30（以30较好）35天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。 4.V-P试验4.1 原理某些细菌能从葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。4.2 方法 同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入6-奈酚酒精溶液1ml和40氢氧化钾为乙液0.4毫升，摇振混合。 试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应，如无反应，应放在361下培养4h再进行观察。（长时间无反应，可置室温过夜），次日不变者为阴性。5.吲哚试验有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚试验阳性。 步骤（1）培养基：蛋白胨水培养基。 （2）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35培养2448h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。 （3）结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。 6糖或醇类发酵试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置361.0C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸