植物分子标记辅助育种∶从文献到实践.doc

Marker-Assisted Selection in Plant Breeding: From Publications to Practice （Crop Sci. 48:391407 (2008).植物分子标记辅助育种：从文献到实践为什么要进行分子标记辅助育种在作物中要进行分子标记辅助辅助育种主要是基于是下列四个方面的考虑 (Young and Tanksley, 1989;Ribaut and Hoisington, 1998; Xu, 2002, 2003; Koebner,2004; Xu et al., 2005): (i)用传统的表型选择较难实施的性状。因为这些性状的鉴定过程比较复杂、代价较高，或性状的外显率低（low penetrance）以及遗传复杂行为复杂等 (ii) 性状的选择依耐于特定的环境或发育阶段，因为这些因素会影响目标性状的表型鉴定（phenotype）(iii) 在回交过程中保留隐性等位基因或者加速育种进程。 (iv) 聚合多个单基因控制性状（例如抗虫或抗病或品质等性状），或有复杂遗传行为性状，这种性状由多个QTL控制（例如干旱耐性或其它加性性状（adaptive traits).有许多关于分子标记辅助育种提高回交育种效率和精确性的模型和模拟研究（modeling and simulation studies）。在大多数农作物中，用适当数量的分子标记（例如相距为10cM的标记）和足够数量的后代，进行分子标记辅助选择，通过两个世代，超过90%的轮回亲本基因型能恢复过来 (Tanksleyet al., 1989).这和传统育种相比明显缩短了育种时间。分子标记辅助回交育种（MABC）中的分子标记可以基于以下几点进行选择(i)它们的基因组分布 (ii) 单倍型多态性或PIC值（haplotype diversity and/or polymorphic information content indices）(iii)它们和侯选基因以及其它农艺性状的关联 (也及非目标性状的其它农艺性状) (Xu, 2003; Varshney et al., 2005b).分子标记辅助回交育种对有多个优良性状但某个单一性状（例如抗虫、抗病性、增加适应性或耐性的某个组分）需要改良的品种培育非常有价值 (Cregan et al., 1999; Cahill and Schmidt, 2004; Johnson, 2004; Niebur et al., 2004; Eathington, 2005; Crosbie et al., 2006; Ragot and Lee, 2007; reviewed by Xu, 2003; Miklas et al., 2006; Dwivedi et al., 2007). 随着高通量基因型鉴定系统（high-throughput genotyping systems）的不断完善，分子标记辅助回交育种将会更加有效(e.g., Gunderson et al., 2005; Syvnen, 2005; Bai et al., 2007), 导入或聚合控制某一性状的多个基因是育种中的一个巨大挑战。育种过程需要综合考虑生物抗性（diverse biotic stress resistances）、非生物抗性、农艺性状、品质性状、产量稳定性等多个因素。MAS和传统育种相比起巨大的优势在于：育种过程中可以用大规模的基因型鉴定的方法实现对多个目标性状和遗传背景的选择。这种综合的分子标记辅助育种策略的最大好处是：达到相同的育种目标，可以极大缩短育种时间；以及通过它实现其它策略难以完成的聚合多个育种有利基因。 当用传统育种方法对越来越多的目标性状进行同步选择时，必须增加育种的成本和周期，才能选到符合要求的材料。但MAS有在同一材料中精确鉴定多个目标性状的潜力，所以能降低成本缩短育种周期。非生物耐性等复杂性状，常常受多基因控制，其间存在难以预测的基因互作，可能还受多种环境因素的影响，所以这类性状的遗传力很低。改良这些性状时，常常产生让人困惑的结果。因此建立诸如此类性状的分子标记辅助育种策略仍然是一个挑战。进行分子标记辅助育种的主要限制因素为了说明分子标记辅助选择在植物育种中的限制，我们先简单介绍下这种方法目前应用的简单概况。私人公司（private sector）已经对有商业价值的农作物，包括玉米(Zea mays L.)、大豆Glycine max (L.)Merr.、 canola Brassica spp.、棉花 (Gossypium hirsutum L.), 和 向日葵 (Helianthus annuus L.)等的基因组学工具的开发进行了充分的投资。使基于育种有利染色体片段聚合产生理想基因型为目标的分子育种的整体策略得以发展。.其中包括对多个目标性状，例如产量、生物或非生物抗性以及品质特定等(Ragot et al., 2000; Eathington, 2005)（其中有几个是多基因控制性状）同时进行分子标记辅助选择（选择仅仅根据分子标记信息）。据报道，在商业化的育种过程中，用这些策略选择的遗传材料是通过表型选择得到的材料的两倍(Eathington, 2005; Crosbie et al., 2006; Ragot and Lee, 2007).虽然，对这些成功的分子育种只有有限的信息能够得到，（不限于MAS）但所有的大型跨国育种公司会在不远的将来把第一个商业化的分子育种产品于投放市场。孟山都公司第一个通过分子标记辅助育种产生的品种已经在2006年投放市场，估计2010年超过12%的美国商业化农作物将来自分子育种(Fraley, 2006).分子标记辅助育种也应用到了公共的育种程序中来进行基因导入（gene introgression）或基因聚合（gene pyramiding）。特别是主要农作物中应用较多，也用到私人公司不感兴趣的农作物的抗病基因的育种。 (Dwivedi et al., 2007). 以小麦(Triticum aestivum L.)为例，在CIMMYT 小麦育种过程中广泛应用了分子标记辅助选择（William et al. 2007）。澳大利亚已经实施了规模了大规模小麦分子标记辅助育种计划，大约20个基因或染色体区域用来进行品种改良.(Eagles et al., 2001).最近几年，美国的MAS Wheat Consortium已经进行了非常成功实施了小麦分子标记辅助育种研究计划，其中包含80个分子标记辅助育种计划。另外还有超过300个回交育种计划正在进行，欲将22个不同的抗病、抗虫基因和21个面包加工及品质等有利等位基因聚合在一起。(Dubcovsky, 2004). 虽然在全世界有上述这些和其它的分子标记辅助育种计划，但令人惊讶的是很少有由分子标记辅助选择产生的品种登记注册。也有个别例子。如两个美国水稻品种(Oryza sativa L.) Cadet 和Jacinto, 它具有独特的包括烹饪和加工品质（包括直链淀粉内容） (Hardin, 2000)；印尼，两个是水稻品种 Angke and Conde, 其抗白叶枯病，产量比IR64高20% (Bustamam et al., 2002). 在common bean (Phaseolus vulgaris L.), USPT-ANT-1 was registered as an anthracnose caused by Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. and Magn.) Bri. and Cav. resistant pinto bean line which contained the Co-42 gene conferring resistance to all known North American races of anthracnose in the U.S. (Miklas et al., 2003). In pearl millet Pennisetum glaucum (L.) R. Br., the parental lines of the original hybrid (HHB 67) were improved for downy mildew caused by Sclerospora graminicola (Sacc.) Schroet. resistance through MAS combined with conventional backcross breeding, leading to the release in India of a new hybrid HHB 67-2 (Navarro et al., 2006).MAS在育种中成功的有限性的另外一种阐释是从第1代DNA分子标记产生以来，QTL作图的文献数量和MAS的文献数量比较。“marker-assisted selection” 在20年以前就在文献中出现，谈到了潜在的应用 (Beckmann and Soller, 1986b) 十年后，随着基因定位研究的报道，该词的应用日益增加. (Fig.1). 然而第一个MAS在植物中应用的报道大是1996年Concibido等做的（Concibido et al,1996），其进行了 soybean cyst nematode (Heterodera glycines Ichinohe) resistance.的分子标记辅助育种。在最近的十年分子标记开发和植物育种中的分子标记辅助选择应用相比发生了戏剧性的增加。包括“markerassisted selection”的文章的数量在2003年超过1000篇（(Fig.1）。虽然MAS已经成功应用到玉米(Johnson, 2004; Niebur et al., 2004; Eathington, 2005; Crosbie et al., 2006; Ragot and Lee, 2007) 大豆(Cregan et al., 1999; Cahill and Schmidt, 2004; Crosbie et al., 2006),等私有公司的品种改良中，但只有有限的公共资金资助在育种领域进行大规模的确认（validation），精细化和应用分子标记辅助选择。这也反应在每年报道文献的增长上。用“marker-assisted selection”检索报道文献量明显少于用“quantitative trait locus” 或“quantitative trait loci”的文献量，近十年差距越来越大(Fig. 1)。另外仅仅有一小部分用“marker-assisted selection”检索出的文献报道的是MAS的应用，而大部分是QTL报道文献中讨论潜在的MAS的应用。大多数MAS的文章是来自于捐赠人的书面调查报告或者学术机构为展示MAS在植物育种中的应用潜力。所以，MAS要从文献过渡的大规模的实际应用要克服许多实践的，logistical，遗传学的障碍。第1 ，发表的标记需要进一步确认，大多数情况需要对一些代表性的育种材料进行分子标记分析。第2，需要发展关于取样、DNA提取、基因型鉴定和简单、快速、和低成本的技术，以及进行数据搜集以便在大规模的系统中应用时保证可靠性及精确性。分子育种家也必须建立样品处理、数据追踪和管理系统确保基因型数据有效地整合到育种过程中. 最后，设计优化的育种系统需要进行模拟分析，也需要强大的决策支持工具帮助育种者做快速精确的选择决策。分子标记系统的优化分子标记的进化自从1980年RFLP出现后，已经发展出了多种类型的分子标记技术（Phillips and Vasil, 2001).最新一代的分子标记技术是基于直接分析序列的变异，而不是用探针（RFLP）或引物（基于PCR的标记）进行间接分析。在序列的单个碱基的改变叫SNP（single nucleotidepolymorphisms），是植物以及动物基因组中最丰富的变异来源。人类SNP数据库中的记录已经超过3千1百万，水稻中超过4百万.(/SNP/snp_summary.cgi).而且，直接序列分析是基因组序列变异分析的最有效的方式。所以，SNP标记比以前的标记有许多优点，包括由于基因组中SNP标记密度较高，更容易发现感兴趣的基因内的标记(Syvnen, 2005).在给定的育种群体中不是所有位点都是多态性的，用高密度的标记更容易在基因内部或起附近区域发现多态性标记。和其它标记相比，这为MAS的实施中提供了一个巨大的便利条件.其它的标记和基因是紧密连锁的（但不是在其内部），这样，标记用到其它有不同重组模式的其他群体时，连锁很容易被打破。同样重要的是SNP标记可以自动化的检测，所以能进行高通量的分析(Syvnen, 2005; Giancola et al., 2006). 当许多重要农作物进行了大规模的基因组测序后，和所有目标性状关联的侯选基因的SNP标记在不久的将来，可以获得 (Lbberstedt et al., 2005).可能更为重要的是，SNP标记在人类研究和诊断应用，使SNP检测技术飞速发展，它可以进一步降低检测成本(e.g., Bai et al., 2007)高通量低成本的基因型鉴定系统 目前DNA提取成本是许多植物分子标记辅助育种中的费用限制因素，尤其是每个样品只需做少量分子标记分析时，使单位数据点的成本变得很高. 因此需要从DNA提取的每个步骤做巨大的努力以便使相关的成本最小化。这包括DNA提取过程中的取样、标签、试剂、塑料制品等各个环节的消耗。PCR扩增反应也是基于PCR的分子标记体系的一个比较昂贵的步骤。多重PCR引物可以用来降低和PCR相关的成本，但这需要预先优化多重PCR反应体系，不过这也并不总是可行的。多重PCR对遗传多样性分析特别有用的。然而当进行遗传作图或分子标记辅助育种时常常需要根据不同的杂交组合或群体进行优化甚至重新设计引物，因为没有在所有组合或群体间都表现多态性性的引物。和分子标记辅助育种相关的另一个比较重要的成本考虑是PCR扩增后的检测成本，不同类型的检测方式成本差别很大。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR标记被认为是适合于单个目标性状的分子标记辅助选择的分子标记。但当对50到200个样品进行凝胶电泳从制胶到成象需要长达3到4个小时。用 microtiter plates 或dot blot detection检测等位基因特异的分子标记可以比基于凝胶的检测通量更高和成本更低。然而，这些方法，若用于多标记遗传背景的选择或者对多个性状进行同时选择，就不太适合。适合大规模MAS的高效的分子标记检测系统是能同时处理大量标记的检测系统。一般说来，发展和优化这样一个系统是比较费时费钱的，也需要有合适的专门技术。大多数公共研究机构不会获得为改进基因型鉴定的方法进行研究的持续投资。一个低成本的、包括普通的标记分析，生物信息分析及其它分析工具的公共平台，将极大的促进育种过程中MAS方法的应用，并且能够确保用最新的技术。 （A centralized out-sourcing platform (and a series of regional service hubs) has been developed for maize through collaboration between Cornell University and CIMMYT which is now being extended to CIMMYTs partners worldwide.） 这可以使热带玉米科学家及育种者能够利用这个平台进行基于基因的SNP标记的目标性状的前景选择，以及加速恢复原始亲本遗传背景的背景选择，促进育种。这将包括发展和优化有效的基因侯选基因的基因特异的SNP标记基因型鉴定平台。这个公共平台将促进研究单位和育种单位共享一套普通的标记，能够加速相互比较和成果转化，也能够快速促进在遗传多样性分析、作图及分子育种中中用一系列普通的SNP标记替代SSR。更重要的是，建立这样一个合作平台，.CIMMYT hopes to provide its stakeholders in developing countries with access to the lowest cost, highes tthroughput genotyping system while also assisting with data comparison, integration, and analysis.最终，当目前芯片中的随机SNP会被来自育种者感兴趣的基因的SNP所取代，多样性分析结果将马上用来进行作图及分子育种等研究。因此，这个首次建立的公共平台，能够为任何研究者提供关于多样性分析、性状作图和通过覆盖整个基因高通量的单倍型进行分子育种等方面的研究。Effective MarkerTrait Association and Marker Validation 在过去的20年中关于QTL发现的报道迅速增加 (如 Fig. 1).目前这中研究已经涉及到所有农作物及所有农艺性状(as reviewed by Dwivedi et al., 2007).然而，目前关于QTL作图的报道主要是基于小到中等规模的群体用相对较小数目的分子标记分析的研究结果，提供了相对精度较低的性状和标记间的关联(性状和标记间的关联，MTA; Xu, 2002, 2003; Salvi and Tuberosa, 2005).很少的QTL用到植物的分子标记辅助育种中。因此看起来好象目前的研究主要是来产生大量的文献，但并不关心其在植物育种中的应用，特别是公共资金资助的项目（许多分析标记-性状关联（MTA）的大多数报道，是基于两个自交系产生的分离群体。在这样的作图群体中检测到的遗传变异（尤其是在目标基因区域的重组模式）可能由于等位基因的多样性，在其它作图群体或育种群体中并不存在。因此，如果没有分子标记的进一步确认或精细定位，在单个作图群体中鉴定的QTL并不能自动地应用到和其并不相关的其它群体中 (Nicholas, 2006). 因此在进行分子标记辅助育种时，和性状关联的分子标记必须在典型的亲本、育种群体以及极端表型个体中进行进一步确认。然而，这个过程可以整合到遗传作图的过程中。在确认过程中有部分分子标记可能会失去其选择能力。在这种情况下，最适合的方法是在目标基因附近的区域开发不同育种群体中都能用的新的标记（通过进行定位或侯选基因分析），在单个基因内部或其附近开发几个标记，这更可能在任何育种群体的亲本间都能找到至少一个多态性标记。这将允许育种者在整个育种过程中跟踪等位基因的来源，加速任意组合间的分子标记辅助育种。高通量多点表型鉴定表型数据的质量及数量已经成为影响遗传作图的精确性的最重要的因素，也直接影响到后续分子标记辅助育种的进行，特别是对于复杂性状。然而，植物样品的准确全面的表型鉴定是非常昂贵和费时的。衡量遗传力的水平主要是考虑表型在不同的季节，不同的地点，不同的环境条件下，是否是稳定重复的。Clustering target locations into mega-environments and comparing these with the success of selection at different locations has been used to understand how breeding programs can optimize their selection processes to generate germplasm with the best yield and other agronomic characters for specific target environments(e.g., Rajaram et al., 1994; Lillemo et al., 2004).从不同群体及环境条件的交叉比较鉴定表型，来确定怎样利用一种环境条件下发现的MTA用到不同的环境中。In this case, well-characterized environments and well established selection criteria are essential prerequisites for the development of a reliable precision phenotyping system.目前正在发展对许多性状精确地高通量多点表型鉴定和高效的取样以及数据搜集系统结合的方法， 这样有潜力对特定性状进行基于表型组的育种。这不仅可以帮助我们理解一个植物发展过程中的表型谱，也能够改善遗传作图的精确度以及目标性状的分子标记辅助选择。降低成本提高规模和效率。如上面讨论到的，基于高丰富SNP的分子标记能够极大的提高选择的精度和效率以及降低分子标记辅助选择的单位成本，因为许多位点可以同时自动化地进行分子标记分析。人类及动物中研究和应用大大地促进了高通量基因型鉴定平台的建立。幸运的是，在动物及人类健康诊断中发现的影响大规模基因型鉴定的因素可以给植物分子育种家提供参考. 在植物中进行大规模分子标记辅助育种的可行性主要受和传统育种相比的相对成本（包括时间和金钱）的大小的影响。成本效益分析将帮助我们确定大规模应用中的瓶颈因素，以及更好地理解系统中哪些组分需要进一步改进。这个领域的初步研究已经在主要禾本科作物中开展，其中包括玉米 (Dreher et al., 2003; Morris et al., 2003)和小麦wheat (Kuchel et al., 2005)，这类分析将会随着新的基因型鉴定系统的出现而不断更新，.在特定的基因型鉴定实验室中进行进一步的条件优化。许多能降低成本的因素可能影响遗传产出，所以成本效益分析应该整合到遗传模型及模拟的育种系统中. 在这一小节中，我们将讨论降低成本以及提高MAS的精度及效率的几种方法。基于单粒种子的基因型鉴定技术在大多数的MAS中DNA提取是单个成本最高的因素，以及整个过程的速度限制因素。发展和优化非破坏性的基于单粒种子的基因型鉴定系统对提高MAS的效率有重要的意义，特别是在耕种季节后期表达的性状。在MAS中用从叶及其它组织取出的DNA与从基于种子的DNA做比较有许多优势。包括 (i)鉴定理想的基因型，在播种前去除不理想的基因型(ii)通过在非播种季的选择提高育种的速度。 (iii) 减少费时和容易出错的样品搜集步骤。用叶片样品时，需要在田间或温室采样，当基因型数据获得后需要进行重新追踪样品(iv) 节约土地，因为只有选择的基因型种植。虽然，在许多植物中已经发展了基于单个干种子中提取DNA的方法，但大多数的报道集中在破坏性的策略。Sangtong et al. (2001)发展了一种检测转基因及其蛋白产品的策略，该方法可以使种子在检测后用来发芽。然而，这种方法不适合大规模，低成本，高通量的MAS。在MIMMYT玉米分子育种过程中已经发展了简单的基于适合于种子相对较大的农作物的单粒中子的DNA基因型鉴定体系(Xu and Crouch, 2007; Shibin Gao, CIMMYT, personal communication, October 2007). 发展快速稳定的MAS用基于单粒种子的非破坏性的DNA提取方法，该方法提取的DNA必须有和通过植物叶片组织提取的DNA有相似的质量，而不会影响PCR扩增和检测过程。相似地，DNA数量能够用来进行全基因组扫描。最后，DNA提取过程，必须是高通量，而分析的样品种子有较高的发芽率。高效的样品追踪在实验室中有许多实验室信息管理系统能搜集和处理测序数据，但能为样品追踪进行基因型数据处理的免费系统还比较少A number of Laboratory Information Management Systems (LIMS) for sequencing data are available, while LIMS for genotyping data are rare with some freely available for sample tracking within the lab (e.g., Hardenbol et al., 2005; Zhao et al., 2005; Jayashree et al., 2006). 一旦建立了高通量DNA提取系统，下一个限速步骤是 样品追踪，也即在MAS过程中每个步骤中都需要迅速地处理大量植物样本，跟踪样品从田间到收获袋到DNA提取容器，PCR扩增，标记检测，然后将选择到的基因型又到田间种植，这是一个费时和容易出错的过程。这个过程也占了整个MAS过程的较多的总体成本。虽然追踪样品从田间到实验室到DNA提取盘到数据库的条形码系统已经在许多私人公司广泛应用，但他们仍然不是足够高效。作为植物育种者，总是和大量植物和群体直接接触，有些作物不能简单 As plant breeders always work with a large number of plants and populations and some crop species cannot be as easily organized in the field as others, 样品搜集处理和追踪的效率决定了是否MAS能高通量地进行以及MAS是否能大规模地进行。选择性基因型鉴定和建池DNA分析有两种广泛应用的方法来鉴定MTA。第一种是用覆盖全基因组的分子标记分析完整的分离群体，然后检测表型和分子标记基因型间的关联。用这种方法，基因型鉴定是费力，费时，昂贵的，由于logistically difficult，获得精确的表型数据比较困难，有时甚至不可能。第二种方法是仅仅鉴定目标性状有极端表型的个体的基因型，然后通过不同表型个体的等位基因频率分布发现和性状关联的分子标记(Lebowitz et al., 1987).结合DNA建池分析和极端表型选择 (so-called bulked segregant analysis)是鉴定和主基因关联的标记最简单和便宜的方法 ，因为它只需要分析代表两种极端表型的DNA池 (Giovannoni et al., 1991;Michelmore et al., 1991). 建池DNA分析方法已经成功地用到植物用RFLP和SSR等标记进行单个主基因的遗传作图中（e.g., Barua et al., 1993; Hormaza et al., 1994; Villar et al., 1996; van Treuren 2001; Zhang et al., 2002)甚至两个或3个QTL(Quarrie et al., 1999).然而，植物中的建池或分组DNA分析有几个问题：(i)标记密度不够(e.g., 1525 cM); (ii) 由于群体较小，检测QTL能力较低，导致有表型差异的池间只能检测有比较大的效应的基因或QTL; (iii) 在池间不精确地估计等位基因频率用基于凝胶的标记系统； (iv)高水平的假阳性 (尽管统计学检验是显著的，但MTA并不是真实的关联). 假阳性通过用确认步骤，包括用侯选标记扫描整个群体等方法去除。Southern blotting methods, though expensive and cumbersome, allow the differentiation of DNA pools with a partial diff erence in allele frequency at a particular locus. Other methods relying on diff erent dyes for the alternative alleles would also allow a similar level of diff erentiation.在人类遗传学中发展的SNP基因型鉴定方法为未来植物分子育种中的可能应用提供了参考。在人类研究中，可以进行基因组规模的关联分析，用包括选择性的基因型分析，DNA池分析，以及用基于芯片的SNP检测方法同时检测100,000个标记(Sham et al., 2002; Meaburn et al., 2006; Yang et al., 2006).。该系统有能力估计来自包含几百个个体的建池DNA样品的等位基因频率和鉴定独特的等位基因。当这种方法引入到植物中能解决许多植物极端群体分离分析方法应用中遇到的上述问题。 (Xu and Crouch 2007). 当对每个个体进行基因型鉴定时可以根据搜集个体的基因型鉴定分来确定等位基因频率；当用建池DNA样品进行基因型鉴定时可以根据信号强度比较来确定等位基因频率。由于在许多植物中基因组规模的高密度SNP标记不久就会获得，所以能够用选择性的基因型鉴定方法在一个步骤中将目标基因位点的范围缩小到1cM以内. 然而，优化SNP标记系统来进行建池DNA分析比SSR标记更复杂，因为存在高水平的冗余。不过，这个在人类基因组学研究中已经成功解决，在最终获得足够建池DNA分析需要的100，000个优化的SNP标记位点前，需要500 000个标记作为起点。在玉米和水稻中，很快就能达到这样的SNP标记密度。所以，建池DNA分析也能用语大规模地分析目前研究还较少的高度异质的landraces 整合多样性分析，遗传作图和分子标记辅助选择遗传作图和MAS中常常包含几个连续的步骤，从发展作图群体到标记评价再到MAS应用。新的适合多种目的的分析策略已经出现。该策略整合了遗传多样性分析，MTA分析，MAS确认和在单个育种群体中应用。要成功地进行整合需要用到多种方法，例如，多个基因型的LD分析，高代回交作图和MAYG方法等。在 MAYG方法中，通过对MAS中产生的新的骨干资源重新作图持续修正评估QTL等位基因的效应，确保QTL的评估和育种过程中的当前的种质资源相关（approach, estimates of QTL allele eff ects are continually revised by remapping new elite germplasm generated during cycles of MAS, thus ensuring that QTL estimates remain relevant to the current set of germplasm in the breeding program.）遗传作图和MAS的整和有两个主要优势： (i)能够用育种群体获得目标性状的分子标记（MTA）而不需要重新构建费时的遗传群体(ii)将MTA开发和确认结合起来。这样能够从开发标记到应用整个过程中均能节省时间。然而，可能最重要的是，整个过程中用的都是育种中用的遗传材料，而不象目前常用的方法，在遗传材料中进行作图，然后在育种群体中进行分子标记的确认，这样大大降低了整个研究过程的冗余水平。Figure 2. Flowchart for large-scale selective genotyping and genetic mapping, including selection of phenotypic extremes from large-sizesegregating populations, phenotype confi rmation, DNA extraction, genotyping, and markertrait association analysis. (A) A procedurefor most target traits which can be scored phenotypically for all individuals or fi xed lines, and then high- and low-phenotypic extremesare selected for further analysis. (B) A procedure particularly suitable for abiotic and biotic stress tolerance where only the phenotypicextreme for tolerance is available under a target environment and comparison is made between the extreme and the phenotypic controlthat is randomly selected from the individuals or fi xed lines under a normal environment.发展同步改善多个性状的育种策略建立多个性状的基于MAS的品种改良策略需要理解不同性状的相互关系（包括一个非常复杂的性状各组分间的互作，例如耐旱性）；多个性状间发育相关性的遗传解析；理解相关性状的遗传网络；以及构建包含多个性状的选择标准。关于作物的抗旱性已经做了许多关于这方面的研究。例如玉米 (Edmeades et al., 2000; ziger et al., 2006) 和小麦 (Babar et al.,2006a, 2006b). 可以发展分子标记辅助选择成套工具，其中包括和一系列主要基因控制性状的分子标记以及为分子标记辅助背景选择的的平均分布于个染色体的分子标记。上千个明确鉴定了的SNP标记可以包含在一张芯片上，该芯片可以不断更新，最终被基于有重要经济价值性状控制基因的功能标记代替。理论上，许多性状的同时选择能够在一个步骤中完成，如果群体足够大，能从中选到目标性状均为优良等位基因的个体。然而，实践中，在一个步骤中，能同时处理的目标性状的数目是有限的，因为随着选择目标性状的增加，群体大小也相应的增加。为了处理选择的目标性状的数量需要的群体比育种群体大的问题，一个两个阶段两代选择的策略被提出来（Bonnett et al. 2005），WANG等进行了模拟研究（Wang et al. (2007)）。.这个策略需要用所有目标标记选择的个体，包括纯合及杂合个体，组成一个亚群体，该群体中包含较高频率的目标性状，这样可以缩小群体大小，在下面的世代中纯合目标位点。理解复杂性状的遗传基础有两个重要的遗传因素影响我们理解复杂性状和用MAS进行品种改良，即基因互作以及基因与环境的互作。大多数主基因控制的性状很少被这两个因素影响，然而，大多数数量性状被这两种因素或其中之一影响。另外，是对复杂性状的育种，尤其是杂交种育种，可能太复杂而不能进行分子标记辅助育种。当包含的基因数量以及环境复杂性增加时，理解基因互作及基因和环境间的互作以及他们和育种过程的联系将更加依耐计算机的运算能力和模拟，这可能是一种唯一的方法，这样能考虑许多复杂的因素。基因互作基因互作在植物育种中的重要性很久就被认识到了(Holland, 2001);然而，它对数量性状的影响还有争议。 QTL作图结果已经显示不同作物以及同一作物中不同性状遗传变异的基因互作的分布有显著差异。不同的结果可能归因于不同的实验设计、群体结构、群体大小和在QTL及遗传学分析中用到的统计方法的不同。在几乎所有的例子中，目前用于检测互作的统计学方法都设计来检测两个位点的互作。这部分原因是包括高水平的互作需要在遗传学模型中提供太多的参数，这需要非常大的群体，所以比较困难。 例如，一个考虑3个位点互做的遗传模型需要群体的大小超过1000才能合理和可靠地估计所有参数。所以，对包含3个以上位点互做的估计是非常困难的。 因此理解复杂的互做效应需要用到如近等基因系等特殊的遗传材料来降低遗传效应的复杂性和群体大小、以及用统和合适的计学方法。基因型和环境的互作人们已经认识到基因和环境互做（QEI）对分子标记辅助选择的制约，because it aff ects both the power of QTL detection and the response to MAS.为了估计QEI，需要在多个不同的环境条件下进行精确地表型鉴定。选择适合的环境进行表型鉴定和精确地估计不同环境条件下的QTL效应是决定获得的QTL能否用效地用于MAS中的两个因素。通过连锁作图或连锁不平衡作图，QEI效应能够整合到MAT分析的统计模型中去。在QTL作图中，当同一作图群体，在不同的环境中进行表型鉴定，有些QTL在所有的环境中都能检测到，但其余的仅仅只能在一些环境中检测到。.然而，即使不存在QEI，由于取样或实验的错误一些QTL可能只在一个环境中检测到，而不能在其它的环境中检测到。如Jansen等提到的，在多个环境条件下，检测到同一个QTL的几率较低As indicated by Jansen et al. (1995), the chance for simultaneous detection of QTL in multiple environments is small.另外一个方面，QEI可能存在于在多个环境条件下都能检测到的QTL中 (Yan et al., 1999).为了确定决定GEI的遗传因子，可以用一个作图群体在多个环境条件下的表型数据估计QEI，也可以通过分析分子标记位点和环境互做的方差比较多个环境条件下的QTL检测估计QEI。(Sari-Gorla et al., 1997). 也可以通过将标记基因型平均值沿不同的环境条件进行回归分析，确定线性回归系数是否显著不同，进而估计QTL和环境的互做 (Campbell et al., 2003).When two or more environments are involved, QEI can be estimated from a complete analysis of variance (ANOVA), Qi + Ej + QEij, where signifi cant QEIs are assessed from the signifi -cance or lack of the QEij interaction terms.低遗传力性状由多个微效QTL控制，增加了相互作用的复杂性，它限制了检测或克隆该QTL的可能性。如果不考虑GEI和基因互做的影响，MAS将是低效率的(Openshaw and Frascaroli, 1997; Moreau et al., 2004).因为GEI和基因互做是重要的，所以我们必须在育种经常在育种过程中重新评估QTL效应。(Podlich et al., 2004). Bernardo and Charcosset等的研究显示，在选择的群体中不进行等位基因效应的评价，即使基因是已知的也会降低分子标记辅助选择效率 (Bernardo and Charcosset ，2006).所以，当有更多的标记可以用或者在育种过程中的遗传机理有了新的认识时，分子标记辅助育种中用的标记或芯片以及和复杂性状相关联的遗传效应评估都需要进一步更新。整合环境变化和分子标记到统计模型中将加速鉴定GEI产生的原因，从而帮助解释QEI。这样可以演绎、理解和发现QEI也能检测受环境高度影响的染色体区域。这些是例如许多重要非生物耐性等复杂性状的非常重要的影响因素。Vargas et al. (2006) Malosetti 等(2004)发展了因子回归分析的方法来进行QTL作图，用例如最高温度和最低温度等环境变量来进行QEI分析。为了全面理解关于复杂性状控制遗传基础以及优化育种过程，计算机模拟和建模成为一种非常关键的工具。另外，作物建模能成为一种消除GEI影响及将复杂性状分解成相对简单组分的强大工具。In addition, crop modeling can be a powerful tool to resolve GEIs and to dissect complex traits into component characters that might be under simpler genetic control.由于QTL作图和建模是互补的两个方面，Yin等提出了一个整合MAS到一个基于模型的理想型框架来支持作物高产育种 Based on the complementary aspects of crop modeling and QTL mapping, for example, Yin et al. (2003) proposed an approach that integrates MAS into a model-based ideotype framework to support breeding for high crop yields.如果这个策略是有效的，需要发展这样的作物模型：在各种环境条件下都能预测群体中不同基因型的的模型。增加公共育种部门对MAS的接受性增加MAS对育种者的可接受性的必备条件是发展更有效的系统，能够容易地整合到大规模的育种过程中。这在资源有限的发展中国家的植物育种过程中是一个非常重要的课题。建立这样的系统可以有多中策略。其中包括在育种早代进行选择去除大多数的分离后代，特别是对高遗传力的性状;在发育的早期用较高的选择压和优化的选择速率进行选择，特别是对大体积植物;用高通量基因型鉴定方法在同一步骤中同时选择多个性状；用低成本的基因型鉴定系统;高效的表型鉴定、样品追踪和数据采集方法；发展和应用快速稳定的方法；以及进行一次基因型鉴定多次表型鉴定。为了增加发展中国家育种者的可接受性最重要的是建设技术和能力和发展设计支持工具帮助改善MAB效率在发展中国家技术和能力培训许多其他因素影响MAS在发展中国家的应用。对参加国家育种计划的研究人员技术培训，使其能够掌握必备技能，并确保育种过程能直接或间接地高效的基因型鉴定能力是最基本的前提条件。新型标记自动化程度的提高使实验室产生分子数据的能力不断提高。目前，总趋势已经由需要高成本的仪器的方法转变到高通量低成本的基因型鉴定方法，从而逐步显现分子基因型鉴定能力对现代植物育种规模的巨大影响。在先进的实验室，特别是动物和人类研究实验室，已经出现了集中化的倾向，包括向外源模式操作(out-sourcing mode)的转变。所以,对植物分子育种，基因型鉴定也可以通过区域集成或外源服务(regional hubs and/or out-sourcing services)的方式高