论文-小叶女贞叶斑病菌孢子萌发条件的研究.doc

小叶女贞叶斑病菌孢子萌发条件的研究摘要：本文研究了不同环境条件对小叶女贞叶斑病菌(Bipolars sorokiniana)孢子萌发的影响。实验结果表明：小叶女贞叶斑病菌孢子萌发的温度范围为638，最适温度22。小叶女贞叶斑病菌的孢子生长的pH范围为410，最适pH为6。最适相对湿度为90%100%。孢子萌发的最适培养基是加有小叶女贞汁液的培养基 。碱性培养基(pH9以上)和黑暗下产生的孢子细而短，延迟孢子成熟，光照则促进孢子的发育。关键字：小叶女贞；叶斑病菌；孢子萌发【Abstract】This paper studies purpus priver Bipolars sorokiniana in different conditions of spore germination result.The temperature range of spore germination of b.sorokiniana is 638 in purpus priver leaf juice, for ascospore germination of the optimum temperature is 22.Spore growth of pH in the range of 410, the optimum pH is 6.For ascospore germination of the optimum relative humidity is 90100.For ascospore of the pathogen,the best source was purpus priver leaf juice .Acid media have little effects on conidial size.the length and wideth of conidium reduced singnificantly when the pH value is above 9. The dark spores produced by fine and short,delayed sporozoite maturation,light promote spore development.【Key words】Ligustrum quihoui Carr. Bipolars sorokiniana, spore germination小叶女贞（学名：Ligustrum quihoui Carr.）是制作盆景的优良树种。常绿并且生长迅速，不仅有着柔嫩的树条，而且生命力很顽强1，这使它成为众多盆景设计者和爱好者的宠儿。不止这些，小叶女贞还是园林绿化的先锋，它能抵抗多种有毒气体，是优良的抗污染树种2。而叶斑病菌引起的叶斑病是小叶女贞主要的病害之一，由于病原菌的侵染会使嫩梢和枝条患病生出病斑，致使物质运输受阻嫩叶枯萎、脱落，以至严重的影响小叶女贞的生长繁殖。随着生活水平的提高，人们对城市生活的需求不再只注重物质享受，而更注重质量，而研究小叶女贞叶斑病菌孢子萌发条件能为花农及园艺工作者根据当地气候情况及时做好小叶女贞叶斑病的防范工作提供科学的参考依据，从而使人们的生活环境变得更加美好、健康。1 材料与方法1.1材料1.1.1实验材料 小叶女贞叶斑病菌1.1.2 实验试剂 MgSO47H2O、蛋白胨、琼脂、无菌水、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、NaH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、0.1孟加拉红溶液、2去氧胆酸钠、链霉素溶液1.1.3 实验仪器 恒温箱，干燥器，电子分析天平，遮阳网（透光率85的规格网），称量纸，酒精灯，锥形瓶，接种环，灭菌锅，培养皿，烧杯，玻璃棒 ，镊子，解剖刀，报纸，棉线，无菌操作台，移液管，洗耳球，胶头滴管，蒸馏器，量筒。1.2方法1.2.1 小叶女贞汁液的制备 将小叶女贞的叶片摘下，称取0.1新鲜小叶女贞叶研碎后加1000mL水煮沸30min，过滤，加水补足至1000mL。1.2.2 马丁氏培养基的配制称量葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，0.1孟加拉红溶液3.3mL，琼脂16g，蒸馏水1000mL。在烧杯中加入约2/3所需水量，然后将各成分一次逐一加入并溶化培养基各成分，按每1000mL培养基加入3.3mL的0.1孟加拉红溶液，待各成分完全溶化后，补足失水。将培养基分装于三角瓶内，加好棉塞，放入灭菌锅内，于121灭菌20min。临用前，加热融化培养基，待冷至60左右，按每1000mL培养基以无菌操作加入20mL2去氧胆酸钠及3.3mL的链霉素溶液（10000U/mL），迅速混匀。1.2.3小叶女贞叶斑病菌孢子的培养在pH为6.0磷酸缓冲溶液（0.2mol K2HPO48.77ml，0.2mol KH2PO41.23ml）中培养小叶女贞叶斑病菌，实验证明该菌产孢温度约1135，适温2024。1.2.4 pH对孢子萌发的影响用NaH2PO4、Na2HPO4配置成pH310共8个梯度的磷酸盐缓冲液3。实验时每处理滴入3滴缓冲液，于22培养3d后取出观察并统计3。由于磷酸盐缓冲液是二级解离，有二个pKa 值：NaH2PO4： pKa12.12，pKa27.21； Na2HPO4：pKa17.21，pKa212.32 配酸性缓冲液：用NaH2PO4，pH34， 配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH59， 配碱性缓冲液：用Na2HPO4，pH1012。1.2.5温度对孢子萌发的影响将小叶女贞叶斑病菌的孢子悬浮液涂抹于马丁氏培养基中，共3组，分别置于6、10、14、18、22、26、30、34、38 培养箱中培养4，每种处理3个培养皿，恒温培养3d后取出，在显微镜下观察孢子的生长情况。1.2.6湿度对孢子萌发的影响于干燥器中，用98浓硫酸将湿度分别调至30、40、50、60、70、80、90、100。将涂有孢子的培养基放入干燥器中，密闭后至于培养箱中5，并在22下培养3d后取出，在显微镜下观察孢子的生长情况，并统计菌落数量。1.2.7光照对孢子萌发的影响将孢子悬浮液分别置于24h光照，24h黑暗，光照、黑暗各12h交替培养，12h光照/黑暗+单层白纸，12h光照/黑暗+双层白纸6，在22下培养3d后，观察孢子的生长状况。1.2.8营养液对孢子萌发的影响分别在孢子悬浮液中滴入3滴小叶女贞汁液、1葡萄糖液、2葡萄糖液、3葡萄糖液、无菌水，以无菌水作为对照组，每组处理重复3次，于3d后取出，在显微镜下观察孢子的生长情况，并统计菌落数目。2. 结果与分析2.1 pH对孢子萌发影响的结果图1 孢子萌发与pH的关系由图1可看出，孢子在pH48均能较好的生长，最适pH为6，研究表明，弱酸性的环境对小叶女贞叶斑病菌孢子的萌发更为有利。2.2 温度对孢子萌发影响的结果图2 孢子萌发与温度的关系孢子萌发与温度的关系如图2所示，在低于6时，孢子无法生长，随着温度的升高，孢子萌发的数量不断增加，在温度为22时，达到最多。以后随着温度的升高，孢子萌发的数量不断减少，在38时停止生长。2.3 相对湿度对孢子萌发影响的结果图3 孢子萌发与相对湿度的关系孢子在相对湿度为30时，无法生长；相对湿度为50时，可以观察到少量的叶斑病菌；相对湿度为70时，生长的菌落清晰可见；在相对湿度为90100时，菌落的数量非常多。研究表明，小叶女贞叶斑病菌孢子的萌发需要大量的水分，而该病在78月雨量充沛时发生，结果与实际情况吻合。2.4 光照对孢子萌发影响的结果表1 孢子萌发与光照的关系24h黑暗24h光照12h光/暗+单层白纸12h光/暗+双层白纸12h光暗 交替组1菌落数/个36111216组2菌落数/个54131119组3菌落数/个37101417菌落平均数/个3.75.711.312.717.3由表1看出，光照对小叶女贞叶斑病菌孢子的萌发有一定的影响。全光照与全黑暗时，生长的叶斑病菌的菌落很少；而光暗交替处理时菌落的数量较多，特别是12h光照/12h黑暗处理后菌落数量最多，加遮阳网则会抑制其生长。2.5 营养液对孢子萌发影响的结果表2孢子萌发与营养液的关系小叶女贞叶 汁液1葡萄糖 溶液2葡萄糖 溶液3葡萄糖溶液无菌水组1菌落数/个1410856组2菌落数/个1312778组3菌落数/个16131067菌落平均数/个14.311.78.75.77如表2所示，在不同类型的营养液中，恒温培养3d后，小叶女贞叶汁液处理的培养基叶斑病菌的菌落最多，其次为1葡萄糖溶液。因此可知，用小叶女贞叶汁液处理的培养基最为适于小叶女贞叶斑病菌孢子的生长，3. 结论与讨论小叶女贞叶斑病菌孢子的萌发受外界环境条件的影响较大，研究发现，小叶女贞叶斑病菌孢子在pH48能较好的生长，但超出范围的酸碱环境却抑制孢子的生长。与朱红惠与姚青7的研究中Gigaspora margarita孢子在不同pH条件下的孢子萌发率没有明显差异的结果不一致，这是由于Gigaspora margarita孢子是AM真菌的休眠体，对环境条件不敏感。而桑利伟等研究香蕉弯孢霉叶斑病菌孢子萌发的pH为59，这与小叶女贞叶斑病菌孢子萌发的pH接近。小叶女贞叶斑病菌孢子萌发最适宜的温度为22，同时，孢子随湿度增加萌发率增高，光暗交替有利于孢子的生长繁殖，与桑利伟等8研究得出香蕉弯孢霉叶斑病菌菌落生长、产孢和孢子萌发最适宜的温度为2530，分生孢子随湿度增加萌发率增高，光暗交替有利于孢子的形成的实验结果不完全一致，这是由于香蕉弯孢霉叶斑病菌与小叶女贞叶斑病菌是不同菌种的原因。小叶女贞叶叶斑病的发生与其孢子的萌发密切相关，由实验结果可知，小叶女贞叶叶斑病孢子的萌发需要较适宜的温度与湿度。所以在雨季来临之前，要对小叶女贞进行修剪，以增强小叶女贞内部的通风透光，同时，要确保小叶女贞的种植地易于排水，降低湿度与温度。在进入7月的雨季后，应减少修剪，以减少伤口，降低病菌入侵的机会，对植株施肥，加强其免疫能力，此外可对小叶女贞进行药物防治，每隔一段时间喷洒一次，直到雨季结束。参考文献1 王凤龙,陈金丰.小叶女贞的栽培管理及用途J.吉林农业,2009,(8)2 王凯,韩远煜.小叶女贞造型树的造型、养护及应用J.现代园艺,2011(9):23-243 郑寰宇,马力,左豫虎,等.马铃薯分生孢子萌发条件J.植物保护,2010,36(6)：91-954 岳梅,雷仲仁,孟涛,等.温度对绿僵菌LA菌株孢子萌发、酶活力及毒力的影响J.植物保护,2010,36(2):56-605 贾文明,周益林,段霞瑜,等.土壤湿度对小麦矮腥黑穗病菌(TCK)冬孢子萌发的影响J.植物保护,2006,32(6)：48-516 杜红红,李杨,李东,等.光照、温度和pH值对小黑桫椤孢子萌发及早期配子体发育的影响.生物多样性,2009,17(2):182-1877 朱红惠,姚青