免疫学实验指导.doc

免疫学实验指导大连医科大学免疫教研室41抗原抗体检测4（一）免疫血清的制备与鉴定4实验一、免疫血清的制备4实验二、免疫血清的鉴定、纯化和保存6（二）血清学反应（Serological reaction）81 凝集反应（Agglutination reaction）9实验三、试管凝集实验（Tube agglutination test）抗体效价测定9实验四、玻片凝集试验（Slide agglutination test）102沉淀反应（Precipitation reaction）11实验五、环状沉淀试验（Ring precipitation test）血迹鉴定11实验六、单向免疫扩散法（Single radil immunodiffusion）正常人群IgG正常值检测12实验七、双向扩散法（Double diffusion）抗原分析14实验八、对流免疫电泳15实验九、免疫电泳（Immunoelectrophoresis）163补体相关试验17实验十一、总补体活性（CH50）的测定17实验十二、补体介导的细胞毒试验19（三）免疫标记技术22实验十三、酶联免疫吸附试验双抗体夹心法22免疫细胞（Immunocyte）23（一）T淋巴细胞检查23实验十四、E玫瑰花环形成试验（E Rosette Test）23实验十五、淋巴细胞转化试验（Lymphocyte Transformation Test， LTT）24实验十六、T淋巴细胞CD亚群测定26实验十七、MTT比色法测定活细胞数量及功能28实验十八、白细胞介素2活性测定28（二）B淋巴细胞检查31实验十九、B细胞膜表面免疫球蛋白（SmIg）的检查直接免疫荧光法（Direct Immunoflurescent method for B Cell SmIg）31实验二十、EA玫瑰花环实验（EA Rosette test）32实验二十一、EAC玫瑰花环实验（EAC Rosette test）32实验二十二、体外抗体形成细胞（Plaque Forming Cell，PEC）检查法33（三）巨噬细胞及嗜中性粒细胞35实验二十三、吞噬细胞吞噬羊红细胞实验35免疫病理学试验36（一）速发型超敏反应（Immediate hypersensitivity）36实验二十四、自动过敏反应豚鼠速发型过敏反应36实验二十五、被动过敏反应36实验二十六、肥大细胞脱颗粒试验37（二）型超敏反应细胞毒型或溶细胞型过敏反应（ Cytolytic or cytotoxic type allergic reaction）38实验二十七、药物过敏性血球减少症检测38（三）型超敏反应38实验二十八 免疫复合物型超敏反应（Immune Complex hypersensitivity）Arthus现象38（四）迟发型超敏反应（Delayed hypersensitivity）39实验二十九、豚鼠结核菌素试验（Tuderculin test）39实验三十、小鼠DNFB试验40实验三十一、小鼠DTH试验40抗原抗体检测（一）免疫血清的制备与鉴定实验一、免疫血清的制备 机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。一种抗原能否引起免疫反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的抗原决定簇。另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。上述条件具备时，抗原经合适途径，选择合适剂量及次数，进入机体内，经过一段潜伏期，抗体水平就逐渐升高，维持高峰，既高效价抗体。利用此原理可制备血清学试验所需的抗血清、各种免疫球蛋白及溶血素等。 制备优质的免疫血清除需要纯化抗原外，还需注意选择合适的动物及注射的途径，抗原剂量、注射次数等有密切关系。（一） 抗原制备和动物的选择1 抗原的制备：为了制备特异性强、亲和力高和效价满意的抗血清，首先要选择合适的抗原。抗原的特异性除与其分子量大小有关外，还与其分子表面上决定簇性质、位置、立体构型有密切的关系。抗原种类可分为天然抗原、人工抗原及合成抗原。在天然抗原中又可分为可溶性抗原（如血清、毒素、组织浸出液等）、颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）及半抗原（本身无免疫原性，必须与载体结合才有免疫原性）。2 动物的选择：实验室多选用家兔、豚鼠（或鸡），商品性生产多用马、羊，特殊情况选用猴。在免疫前应预先测定体内有无存在低滴度交叉反应的天然抗体。（二） 抗原的注射途径和剂量1 注射抗原的途径：通常可采用静脉、腹腔或皮下途径，皮内或肌肉途径较少采用。近期发展在局部淋巴结或足 等部位注射抗原。不同途径，抗原在体内代谢速度不同，因而产生抗体的水平不同。在皮下组织中能长期贮留的抗原，特别是与佐剂相混合的抗原，可以从皮下组织内缓慢释放出来，有利于抗体的产生。2 抗原剂量及注射次数：应随抗原的性质而异。3 每次注射间隔时间：不同抗原和不同免疫方法，可从数日到数周，一般无佐剂抗原为24天。加佐剂抗原为1015天。（三） 佐剂的作用原理及种类：1 原理：佐剂又称免疫增强剂。它可以增强抗原的免疫原性及改变机体的免疫反应性，达到增强免疫力或提高抗体产生水平及在体内维持时间明显延长。2 种类：通常多用福氏佐剂（Freund adjuvant） ，它分为福氏不完全佐剂（Incomplete Freund adjuvant）和福氏完全佐剂（Complete Freund adjuvant）。福氏不完全佐剂既抗原水溶液（15mg/ml）1ml、油剂（液体石蜡）4ml、乳化剂（羊毛脂）1g混合而成油和水的乳悬液。福氏完全佐剂在上述成份中按10mg/ml加入卡介苗。3 配制方法：先将羊毛脂与液体石蜡混合分装小瓶，高压蒸汽灭菌，8磅20分钟，保存4冰箱，使用前再溶化，制备可分研磨法和注射法。前者将乳悬液在微火上溶化后，按比例加入卡介苗，边滴边研磨，使菌体完全分散，按同法加抗原，每加1滴应研磨数转直至小滴消失，加抗原要慢，待抗原全部滴入后则成乳白色粘稠的油包水乳剂。后者将等量的乳悬液和抗原卡介苗混合液分别吸入两个附有针头的5毫升注射器内。将其之一与约长6厘米的塑料管连接，针头穿入约1厘米，然后稍稍推动针管，使液体进入塑料管直至距塑料管开口端还有1厘米距离为止，同时由另一人将另一个5毫升注射器与塑料管开口端相连，此时二人相对而坐，左手固定针头与注射器的连接处，右手交替推动针管，反复操作，直至形成粘稠的乳剂为止。 制成的乳剂是否油包水乳剂，直接影响到免疫的效果，因此每次制成后要进行检查。方法是将佐剂抗原滴入冷水表面，滴入后应保持完整而不分散，若滴入后分散，说明不合格，要另行配制。（四） 免疫的方法：1 无佐剂免疫法：应根据抗原的性质采用合理方法。颗粒性抗原（红细胞、细菌）通常不需采用加佐剂方法。将某种抗原（浓度约1%）根据下列的顺序、每次间隔35天免疫动物（兔） 皮下注入抗原 0.3ml 肌肉 0.4ml 足 0.4ml 静脉（耳） 0.4ml 皮内 0.5ml于最后一次注射后7天，采耳血，分离血清，用特异抗原测定其效价。2 福氏佐剂免疫法：1） 一般免疫方法：第一针剂量为每只家兔注射1毫升加佐剂的抗原。注射途径为两只后足掌，每只0.2毫升，其他各淋巴结附近部位，多点皮内注射。总量为0.6毫升。第二针间隔在第一针免疫后34周。剂量为不加佐剂的抗原1毫升。注射途径为背部多点皮下注射。 第三针间隔时间为第二针免疫后12周，剂量和途径同第二针。2） 淋巴结免疫法，卡介苗致敏：每只兔后足各注射活卡介苗（75mg/ml）0.3ml，1014天后两侧 窝淋巴结可肿大，如蚕豆大小，既可作淋巴结注射。 第一针于两侧 窝淋巴结内注射佐剂抗原（1mg/ml），每个淋巴结内注射0.25ml。注射加强针，两次间隔时间、注射次数、剂量、途径与一般免疫方法相同。（五） 采血1 试血：一般在最后一次注射后的710天，既可由耳缘静脉取少量血，分离血清进行试血。多采用环状试验，在10分钟内能出现“+”沉淀环为合格。目前更多采用双向扩散法，经3724小时后观察结果，效价在1:16以上既可用。2 放血：当免疫血清效价达到所需要滴度时，由心脏或颈动脉用无菌手续采血。（六） 分离血清： 将收集血置无菌试管或三角瓶内，凝固后，用无菌滴管沿试管边缘将血块与瓶壁脱离，先放37，2小时后，再放4过夜，使血清充分析出，经离心2000rpm，20分钟，分离出血清，待鉴定合格后方可使用。实验二、免疫血清的鉴定、纯化和保存一、 免疫球蛋白的提取与鉴定： 各类免疫球蛋白及其与其它血清蛋白间，根据它们的分子大小、电离密度、等电点以及在水溶液中的溶解度不同等，得以相互鉴别与分类。利用上述特性，还可以从液体中分离和提取各种免疫球蛋白。（一） 免疫球蛋白的分离提取：1 盐析法（Salt fractionation）：蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同。血清球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。其方法步骤如下：（1） 配制饱和硫酸铵溶液：取500ml蒸馏水加热至7080，将400g硫酸铵溶于其中，搅拌20分钟，冷却。待硫酸铵结晶沉于瓶底，其上清即为饱和硫酸铵。在使用前用28%氨水调pH为7.0。（2） 用50%饱和硫酸铵提取血清中、球蛋白：血清一份加生理盐水一份混匀，然后逐滴加入饱和硫酸铵二份中，边加边搅拌，防止形成团块降低沉淀物的特异性。混匀后静置30分钟或置4冰箱过夜。（3） 高速低温离心10000rpm，10分钟，将上清液（含白蛋白）弃去，取沉淀物（含球蛋白）溶于少量生理盐水中。（4） 用33%饱和硫酸铵提取球蛋白，方法是将上述提取物生理盐水溶液两份加一份饱和硫酸铵。然后再离心10000rpm，其余操作同上。（5） 按同样方法用33%饱和硫酸铵再提取一次。（6） 将提取物装入透析袋，在生理盐水中透析，以除去其中所含的硫酸铵。 经盐析法提取的蛋白质为粗提的免疫球蛋白，若要获得纯化的免疫球蛋白，必须经凝胶过滤或离子交换层析提纯。2 凝胶过滤法（Gel filtration）： 利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶做为介质，可分离提纯分子量不同的大分子物质。在凝胶过滤过程中，分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先流出凝胶柱外，分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢而最后流出柱外，这样就能将分子量不同的物质分离。（1） 材料： 样品（正常人血清），Sephadex G-200，2.5100mm层析柱，洗脱液（PBS或含NaCl的TrisHCl缓冲液）。（2） 方法：处理凝胶：将Sephadex G200用蒸馏水经充分膨胀后进行浮选。装柱：在层析柱底部铺加一层尼龙纱，然后将洗脱液饱和凝胶粒子沿插入柱底的玻璃棒缓缓倾注于层析柱内。加样：在凝胶柱表面再加一层尼龙纱，沿管壁缓缓加入样品，所加样品的体积不超过凝胶柱的10%。洗脱：洗脱液洗脱，流速20ml/小时。待样品洗脱下来（用20%磺酸水杨素检测）既用试管分段收集。蛋白测定：在紫外分光光度计上测定各管样品的O.D280nm，以判读各管蛋白含量。 附：样品洗脱完毕后，凝胶即已再生。一次装柱可反复使用多次。凝胶悬液加防腐剂后于冰箱内可保存数月。（3） 结果分析：正常人血清经凝胶过滤后可分出三个主要蛋白峰。IgM是在第一峰中，和IgM分子量接近的2巨球蛋白也在第一峰。第二峰主要是IgG，在第二峰开始部分含IgA和IgD，第三峰为蛋白和分子量100，000以下的球蛋白。3 离子交换层析法（Ion exchange chromatography）： 以离子交换剂为介质，吸附带相反电荷的高分子物质，由于高分子物质的电荷量，等电点不同，用不同离子强度或pH值的洗脱液能置换不同的高分子物质。据此可分离提纯免疫球蛋白，是目前最广泛应用的高分子物质提纯方法之一。（1） 材料：样品（经pH8.0，0.015M PB透析过的正常人血清，或经饱和硫酸铵提取的免疫球蛋白），DEAE纤维素（阴离子交换剂），2.525cm层析柱，及洗脱剂（不同离子强度的PB）。（2） 方法：离子交换剂的预处理：取适量DEAE纤维粉剂，用0.5N NaOH除去色素和细粒，用蒸馏水洗成中性后，再用0.5N的HCl洗涤，最后用蒸馏水洗成中性并用缓冲液平衡。装柱：与凝胶过滤相同。加样：在层析柱顶部留有少量缓冲液时，既开始加样。在样品渗入柱内液面约留有0.5ml时，以数毫升缓冲液冲洗柱壁。然后滴加洗脱剂并调整流速为12ml/分，进行洗脱。洗脱：根据提取免疫球蛋白种类的不同而选择不同pH及克分子量（molar solution “M”）。例如提取血清IgG用0.01 M pH7.4洗脱，而血清IgA则为1M pH6.4为洗脱液。蛋白测定：同凝胶过滤法。（二） 免疫球蛋白的鉴定：1 血清学方法鉴定： 经提纯的免疫球蛋白可做为抗原，用已知的抗血清进行鉴定，方法可选用琼脂单向扩散法、双向扩散法及免疫电泳等方法。2 聚丙稀酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）： 聚丙稀酰胺凝胶电泳是利用丙稀酰胺（Acrylamide,Acr.）与双丙稀酰胺（N,Nmethylene Bisacrylamide,Bis）在催化剂作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳，因此它兼有分子筛效应与电泳效应。各种蛋白质分子通过凝胶孔时所受阻力程度与其大小、形状有密切关系，因此可分开泳动率很相近而分子大小形状不同的蛋白质。可用于鉴定和分离高分子物质。（1） 材料：样品（提纯的免疫球蛋白），丙稀酰胺，加速剂（TEMED或DMPN），催化剂（过硫酸铵），Tris（三羟基氨基甲烷），HCl，甘氨酸，20%蔗糖，0.5%溴酚兰，0.05%氨基黑染液，5%醋酸，园盘电泳仪。（2） 方法：配制聚丙稀酰胺凝胶： 贮存配制： A液（pH8.9 TrisHCl缓冲液）：48ml 1N的HCl加36.6g Tris，再加蒸馏水至100ml。 B液：28g丙稀酰胺加0.735g双丙稀酰胺，再加蒸馏水至100ml。 工作液配制： 甲液：1份A液，2份B液，1份蒸馏水混匀。 乙液：0.4g过硫酸铵加蒸馏水100ml。 临用前以甲液1份+乙液1份+DMPN或TEMED（配8ml工作液时加2滴）。配制电极缓冲液（pH8.3的Tris甘氨酸缓冲液）： Tris6.0g加甘氨酸28.8g，加蒸馏水至1，000ml。临用时将此液再稀释10倍。聚胶：在电泳园盘上装入凝胶管，下口用玻璃珠堵塞，加入配制好的凝胶工作液。凝胶面上加0.5mm水层，凝聚后再吸去水层并取下玻璃珠。加样：加入血清或提纯的免疫球蛋白约10l，样品上加1滴20%蔗糖（防止样品与电极缓冲液对流）。为便于示踪，样品内可加0.5%溴酚兰5做指示剂。最后在样品管和电泳槽中加满电极缓冲液。电泳：每管3mA，电压220V，泳动3小时。染色：从管中取出凝胶，浸于0.05%氨基黑染色液中染色约半小时，再放入5%醋酸中脱色至无余色脱下为止（约需1天）。（3） 结果分析：可以通过标准品进行定位。（三） 保存： 经鉴定合格后，将免疫血清中加1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其最后浓度分别为0.01%，或0.05%，然后将免疫血清分装12ml小瓶（或安瓶）内，放20冷冻，可保存二年，如有条件可将免疫血清冷冻干燥保存。（二）血清学反应（Serological reaction）血清学反应是免疫学实验中最基本的实验，它可以利用已知抗原检测未知的抗体（如病人的血清标本），也可以用已知的抗体诊断未知的抗原（如自病人分离的病原微生物），因此在临床免疫学诊断中具有十分重要的地位。目前，血清学试验虽已有很多发展 ， 但仍归属于以下三类，既：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。1 凝集反应（Agglutination reaction） 以凝集反应原理为基础的实验中，除最基本的试管凝集实验及玻片凝集实验外，尚有乳胶颗粒间接凝集抑制试验、间接血细胞凝集试验及葡萄球菌A蛋白（SPA）协同凝集试验等。由于乳胶颗粒间接凝集抑制试验妊娠试验已为酶联免疫吸附实验所替代，而间接血细胞凝集试验及SPA协同凝集试验又多用于微生物学诊断实验范畴，故以上三试验均不重复介绍。实验三、试管凝集实验（Tube agglutination test）抗体效价测定【原理】 大分子颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）与其相应的抗体相结合，在适量的电解质存在及一定的温度下，经过一定的时间可出现肉眼可见的凝集团块，是为凝集反应。 试管凝集实验的应用，一般均以标准抗原（已知抗原）测定免疫血清或患者血清中抗体的效价。【材料】 1:10抗羊红细胞免疫血清（配制前需经5630分钟灭活） 1%绵羊红细胞生理盐水悬液 生理盐水 试管及1ml刻度吸管 试管架及吸液橡皮乳头、红蜡笔 恒温箱【方法】1 取试管8支，排列于试管架上并做好标记。2 每管各加入生理盐水0.5ml。3 吸取1:10抗绵羊红细胞免疫血清0.5ml加入第1管中并充分混匀。4 自第1管中吸出0.5ml加入第2管中，经充分混匀后吸出0.5ml加入第3管中，如此依次稀释至第7管，混匀后吸出0.5ml弃去。此时17管所含免疫血清的稀释度为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640，1:1280第7管不加免疫血清做为对照。5 18管每管各加1%绵羊红细胞悬液各0.5ml。（注意：加入前必须将红细胞悬液充分混匀）。6 此时第17管的血清最终稀释度为1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560。7 摇匀后，静置于37下，1小时后观察结果并写出实验记录。【结果】1 观察前切勿摇动试管，以免凝集分散。2 首先应观察对照管，该管因无相对应的免疫血清故不应有凝集现象，血球应全部沉于试管底部呈规则园盘状。如出现凝集现象则说明实验操作有误或血球本身有自凝现象，试验结果不能成立。3 再观察16试验管，并以+、+、+、+，分别表示凝集强度，不凝集者记以“”。+：完全凝集，呈厚膜状铺于管底，边缘呈锯齿状。+：血球呈薄层贴于管底，边缘不齐。+：中央呈较小园盘状沉淀，边缘凝集呈颗粒状。+：血球呈较大的园盘状沉淀，边缘有少量凝集颗粒。：无凝集，血球沉于管底园盘状。4 以血清最高稀释度仍能出现“+”凝集现象者，作为该免疫血清的效价（滴度）。例如，在本次实验中第5管（1:640）呈“+”凝集，第6管（1:1280）呈“+”凝集或“”，对照管为“”，则该血清的效价为1:640。注：1 免疫血清在实验前须经5630分钟灭活，是指对免疫血清中所含补体活性的灭活，如不灭活处理则直接影响凝集结果，例如在本次实验中高浓度的免疫血清可使血球出现溶解现象。2 本次实验对凝集反应判读结果的方法，仅属对红细胞凝集的判读，而对其它颗粒性抗原（如细菌菌体抗原）在凝集反应中判读结果的方法则在微生物学实习指导中另有说明。实验四、玻片凝集试验（Slide agglutination test）【原理】 玻片凝集的原理与试管凝集相同，一般均用于诊断未知抗原，如用已知的免疫血清诊断未知的细菌和血型鉴定等。由于方法简便，并具有较高的敏感性和一定的特异性，故迄今仍为各实验室所应用。玻片凝集的反应时间短（应在25分钟左右出现凝集），因而对免疫血清的浓度应相应提高（如该免疫血清试管凝集效价在1:1280以上时，应做1:20稀释以作为玻片凝集的抗体最合适的稀释度）。本实验方法只能用作定性实验。【材料】 1:20抗羊红细胞免疫血清（用生理盐水配制） 1:20抗鸡红细胞免疫血清（同上） 羊红细胞及鸡红细胞 生理盐水 载玻片、尖吸管、红蜡笔、牙签等。【方法】1 取洁净载玻片一张，用红蜡笔画分三格并标明次序。2 用尖吸管3支分别取抗鸡、抗羊红细胞免疫血清及生理盐水各一滴，分别滴加于载玻片所画出的三个格内。（或用微量加样器分别各取25l加至载玻片三个格内）。3 再用另一支尖吸管吸取羊或鸡红细胞一种，于三格内各加入一滴（亦可用微量加样器每格内各加25l）。4 用牙签将血细胞与免疫血清及生理盐水充分混匀。注意每混匀一格必须更换牙签或将使用过的一端折断才能混匀另一格，否则将会出现交叉凝集，影响实验结果。5 将玻片轻轻摇动12分钟，观察结果并记录报告。2沉淀反应（Precipitation reaction） 可溶性抗原与相应的抗体相结合，当两者比例合适并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。与相应的抗体比较，抗原分子小（0.2微米），单位体积中所含的抗原量要多，具有较大的反应面积。为了使抗原抗体之间比例合适，不使抗原过剩，故一般均应稀释抗原，并以抗原最高稀释度（可达1:40,000）仍能与抗体出现沉淀反应为该抗体的沉淀反应效价（滴度），如环状沉淀试验。若需用稀释抗体的方法测定该抗体的效价。则需将免疫血清做高浓度低倍稀释（自1:41:140左右）并将抗原制成一标准浓度才能进行检测，否则就不能出现反应，如单向及双向免疫扩散试验。根据抗原与抗体的不同条件及其它因素，沉淀反应可以分为以下三种主要形式。既：环状沉淀反应（Rnig precipitation reaction）；凝胶中沉淀反应（Precipitation reaction in gel），如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳等；及微生物学实验中的絮状沉淀反应（Floccuiation precipitation reaction），如梅毒血清中的康氏（Kahn）及克莱氏（Kline）试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验Elek氏试验，检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。实验五、环状沉淀试验（Ring precipitation test）血迹鉴定【原理】 在环状沉淀试验中，当可溶性抗原与相应的特异抗体结合后，于两者交界面处可形成白色沉淀环。本试验的最大优点是具有相当高的敏感性和特异性，这主要取决于具有高效价的特异抗体和制备抗体时抗原的纯度程度。如某些特异抗体的效价可达1:20,0001:40,000或更高，即将相应的可溶性抗原做1:20,0001:40,000倍稀释后仍可出现反应。因此，在检测微量抗原时本试验虽属经典的沉淀试验，到目前为止仍有其实用价值。【材料】 滴有未知血迹的干燥纸片3种，分别置于一洁净试管中，并注明标本No:1、No:2、No:3。 抗人血清抗体、抗羊血清抗体及抗鸡血清抗体。 生理盐水 1ml吸管、尖吸管及橡皮乳头等。 环状沉淀管及环状沉淀管架。【方法】：1 取环状沉淀管3支，用3支尖吸管分别加抗人、抗羊及抗鸡血清抗体各约0.1ml于沉淀管底部，并注明，置于环状沉淀试管架上。2 取置有任一未知血迹纸片的试管并加入生理盐水1ml。3 放置室温510分钟后，将血迹纸片溶解于生理盐水中的微量血清混匀。4 用尖吸管吸取上清液，分别缓缓加入上述含有抗人、抗羊及抗鸡血清抗体的沉淀中，并使两者呈一清晰界面。（因血清的分子密度及比重均大于生理盐水，故当加入含有抗原之生理盐水时只须将沉淀管倾斜，加抗原的尖吸管勿接触抗血清，使含抗原的生理盐水沿管壁缓缓流下，再将沉淀管直立即可呈一清晰界面）。5 在加入抗原时，尖吸管的尖部切勿触及下面的抗体部分，否则不仅使抗原抗体混合，不能呈清晰界面，而且如再用此尖吸管加抗原于另一支含不同抗体的沉淀管中后，必然会出现交叉反应，无法判读结果。6 置室温下15分钟，观察结果。【结果】 根据实验结果，对待检血迹标本做出实验报告。实验六、单向免疫扩散法（Single radil immunodiffusion）正常人群IgG正常值检测【原理】 在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，既形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml或IU/ml）。 应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的含量及正常值。【材料】1 示教部分： 2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2NaN3） 标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产） 参考蛋白工作标准（北京生物制品研究所生产） pH7.2 PBS 玻璃板或载玻片。 打孔器（孔径3mm）及打孔模板。 微量加样器 湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）2 实验部分： 已制备好的含有马抗人IgG抗体的1%琼脂板。 1:50稀释的单人份待检血清标本。 打孔器、模板、微量加样器及湿盒等。【方法】（一） 标准曲线的制备：示教1 按照玻片的大小，以能制做11.5mm厚度的琼脂板的量，分装其1/2量的2%盐水琼脂。例如，用普通载玻片制做时其1%琼脂量为4ml，在分装2%盐水琼脂时既为2ml。溶化后置5660水浴中平衡温度备用。2 稀释抗体：将标准抗人IgG抗体按其效价用pH7.2 PBS做成1倍稀释。例如，血清效价为1:140，原浓血清既应稀释为1:70。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。3 制板：将已稀释的抗人IgG抗体于56水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持5660的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管12次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），迅速倾注于玻片上，待凝固后既制成。4 打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。5 稀释不同浓度的参考蛋白标准（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG为100单位/ml，80.4微克/单位，其稀释范围为1:10、1:20、1:40、1:80及1:160。6 加样：将已稀释的不同浓度的工作标准顺序用微量加样器每孔加入10l（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。7 置湿盒中，放37温箱，24小时后观察结果。8 用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，不同单位/ml为横座标，绘制成标准曲线。 在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。（二） 正常人血清中IgG值的测定：1 将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4个（孔径3mm，孔距10mm）。2 将单份正常人血清用pH7.2 PBS分别作1:50稀释。3 用微量加样器分别取1:50稀释的单人份血清标本10l加入孔中，每份标本应各加两孔（每份标本均应更换塑料吸头）。4 作好标记置湿盒中，放37温箱，24小时后观察结果。【结果】 测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的单位/ml，并换算为mg/ml。 将全班实验结果做出统计及均值，并写出较完整的实验报告。实验七、双向扩散法（Double diffusion）抗原分析【原理】 双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。【材料】 生理盐水1%琼脂管（每管约4ml） 载玻片 打孔器及打孔模板 微量加样器及塑料吸头 抗体及抗原1、2、3、4、5、6。 湿盒【方法】1 将已溶化的1%琼脂盐水管放5660水浴箱中平衡温度备用。2 将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.54ml，使成厚度约1.5mm琼脂板。3 凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次实验采用三角型，即每一个三角型的三个孔为一组。（因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则，如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果）。4 用微量加样器加抗体各10l。各组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组，分别各加入10l。注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影响实验结果。5 作好记录，放湿盒中，置37温箱，24小时后观察结果。【结果】 说明：（1） 融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。（2） 两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。（3） 融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分，此为部分同一性反应。实验八、对流免疫电泳【原理】对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis，CIEP）是指在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗体在琼脂凝胶中，由于电泳和电渗作用抗原，抗原向正极移动，抗体向负极移动。将抗原放负极端，抗体放正极端，则抗原抗体相向移动，在两孔之间相遇，在比例合适时形成沉淀线。以Sm和RNP（核糖核蛋白）等可提取性抗原（extractable nucleat antigen，ENA）检测相应抗Sm和RNP为例。【材料】1 Sm/RNP抗原制备 将新鲜或冻存于-30的小牛胸腺除去脂肪与结缔组织后，用0.004 mol/L 氯化钙-0.28 mol/L蔗糖溶液洗净，切碎。每50 g胸腺加上述含钙0.28 mol/L蔗糖450 ml。于匀浆器中慢档（约8000 r/min）匀浆23 min（速度过高，核可能破坏）。两层纱布过滤，滤液1500 r/min离心20 min，弃上清液（胞浆成分）。沉淀（核）用0.004 mol/L氯化钙-0.25 mol/L蔗糖洗1次。用50 ml pH 7.1 0.1 mol/L PBS（或pH 7.2 0.01 mol/L PBS）将沉淀物悬起，于匀浆器中快档匀浆23 min，使核破碎。4过夜后用纱布滤除不溶性物质，滤液以30000 g 4离心1 h除去沉淀物。上清液按10 mg/ml比例加入醋酸钠干粉，缓慢搅拌至溶。加入6倍体积的无水乙醇，发生絮片状沉淀，10 min后1500 r/min离心10 min。弃上清液，沉淀中加入生理盐水20 ml，使大部分溶解，1500 r/min，弃沉淀。上清液对蒸馏水透析后分装，冷冻干燥保存。2 待检血清和已知抗ENA阳性血清。3 PH 8.6 0.05 mol/L巴比妥缓冲液。4 琼脂、载玻片、吸管、毛细滴管、打孔器、电泳仪、电泳槽、万用表、适量滤纸或纱布。【方法】1 制备1.2%巴比妥缓冲琼脂凝胶板 先用生理盐水50 ml加1.2 g琼脂隔水煮沸融化，再加50 ml pH8.6 0.05 mol/L巴比妥缓冲液继续隔水煮沸至澄清，取融化的琼脂3.54 ml，浇于载玻片上，冷却后打孔。2 打孔 用打孔器（或用绘图笔尖）成对打孔，孔径3 mm，孔距6 mm。3 打样 先于阳极侧孔内加待检血清或阳性对照血清，10 V/cm电压，电泳30 min（时间可随具体实验条件加以调整），再于阴极侧孔内加ENA抗原（巴比妥缓冲液溶解的），继续电泳约45 min。4 待阳性对照血清孔与ENA抗原孔之间出现白色沉淀线时停止电泳。5 初步观察后，将凝胶板置湿盒继续扩散24 h。【结果】判定结果时，待检血清如含抗RNP与抗Sm两种抗体则在与ENA抗原孔之间出现两条沉淀线，靠近阴极侧的沉淀线由抗Sm与相应抗原形成，靠近阳极侧的沉淀线则由抗RNP与相应抗原形成。如只出现一条沉淀线，则须与阳性对照血清参比，以判定其性质。由于Sm抗原可耐561 h，RNP则遭破坏，故也可将ENA抗原加热处理后再与待测血清作对流免疫电泳。对流免疫电泳简便、快速、敏感度较双向琼脂扩散试验高816倍（如测AFP敏感度为2.55.0g/ml），但分辨力低于双向琼脂扩散。注意事项本方法以高电渗为其特点之一，但电渗作用过强会使多数蛋白质向阴极移动，因此不宜使用电渗作用过强的琼脂。如果抗原也是免疫球蛋白，或抗原抗体的扩散率比较接近，会导致电泳时抗原和抗体向一个方向移动，不能形成对流效应，这种情况下不宜做对流免疫电泳。实验九、免疫电泳（Immunoelectrophoresis）【原理】 免疫电泳法是指利用凝胶电泳与双向免疫扩散两种技术结合的实验方法。在电场作用下标本中各组分因电泳迁移率不同而分成区带，然后沿电泳平行方向将凝胶挖一沟槽，将抗体加入沟槽内，使抗原与抗体相互扩散而形成沉淀线。根据沉淀线的数量、位置及形状，以分析标本中所含组分的性质，本实验常用于抗原分析及免疫性疾病的诊断。【材料】 1%离子琼脂（pH8.6巴比妥缓冲液加入等量蒸馏水，再加入1%琼脂，溶解后用脱脂棉过滤，分装试管，实验前加热溶解置5660水浴箱中平衡温度备用）。 免疫电泳用玻片 待检血清 人IgG（1mg/ml） 抗人全血清抗体 微量加样器及塑料吸头 尖吸管及橡皮吸头 打孔器、解剖刀、尺、打孔模板、湿盒等。 电泳仪：将pH8.6巴比妥缓冲液注入电泳槽内（注意正负极各槽内所加入的量应在同一水平），并将滤纸裁成适当长度和宽度以备搭桥使用。 附：pH8.6巴比妥缓冲液配制方法 巴比妥钠（Barbital Sodium）10.3g 巴比妥酸（Barbituric Acid）1.84g 蒸馏水1000ml1 称量巴比妥酸置一三角烧瓶中加蒸馏水200ml于煮锅内加热溶解。2 称量巴比妥钠置另一容器中加蒸馏水700ml，摇动溶解。3 将已融化的巴比妥酸溶液与巴比妥钠溶液混合，用蒸馏水补足1000ml。4 混匀后，用精密pH试纸测定pH值，备用。一、 实验方法：1 取已溶化的1%离子琼脂倾注于玻片上制成琼脂板。2 冷却凝固后，按照模板于挖槽线上下两侧各打孔一个，并分别用微量加样器加入待检血清及人IgG各15l。3 置电泳槽内，注意电泳标本应放负极“”一侧。并将已浸透缓冲液的滤纸一端覆盖于琼脂板两侧各约0.5mm，另一端浸于电泳液中。4 接通电源。电压、电流及时间应视仪器性能而定。一般电势梯度6V/cm，电流每板20mA，泳动时间12小时。5 电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板。按模板位置用解剖刀挖横槽，用特制尖吸管加入抗人全血清抗体。6 置湿盒中，于37温箱中扩散24小时。【结果】 根据沉淀弧的位置及形状，参照免疫球蛋白迁移范围示意图，识别主要Ig。3补体相关试验补体作为机体所固有的非特异性防御组分，能增强特异性抗体和抗原结合后所产生的反应，广泛参与机体的抗微生物防御反应以及免疫调节，亦可参与一些变态反应疾病和自身免疫性疾病的病理过程，引起组织损伤和破坏。另外补体组分的先天性缺陷也可导致疾病的发生。因此需要进行补体总活性的测定及补体单个成分的测定。根据抗原抗体在结合过程中能激活补体而设计了补体结合实验和补体介导的细胞毒实验，补体结合实验曾用于检测多种细菌病毒的抗原或抗体，因易受多种实验条件的影响，已渐被其它方法所取代，补体介导的细胞毒实验可用于带各种抗原细胞的检测，如进行细胞MHC抗原的鉴定、T淋巴细胞总数或其亚类的计数。实验十一、总补体活性（CH50）的测定【原理】补体能使溶血素（抗绵羊红细胞抗体）致敏的绵羊红细胞（SRBC）发生溶血，当致敏的绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性呈正比例关系。因此，将新鲜待检血清做不同稀释后，与致敏红细胞反应，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清量判定终点，可测知补体总溶血活性。以50%溶血判断结果比100%溶血灵敏、准确。【材料】1. 待检人血清：静脉抽血，待凝后立即分离血清进行测定或-70保存。2. 缓冲盐水（pH7.4）：取NaCl 75g，1mol/L HCl 177ml，三乙醇胺28ml，MgCl26H2O 1.0g，CaCl22H2O 0.2g。先将NaCl 溶于700 ml蒸馏水中，再加入HCl和三乙醇胺。将MgCl26H2O和CaCl22H2O分别 用2 ml蒸馏水溶解后，逐一加入，再用蒸馏水加至1000 ml，4保存。临用前取上述溶液1份加9份蒸馏水，4保存待用。3. 2%SRBC悬液：新鲜脱纤维羊血或Alsever液保存羊血（4可保存3周）用生理盐水洗2次，第三次用缓冲盐水，2000rpm离心30min。取压积红细胞以缓冲盐水配成2%悬液。为使浓度标准化，可将2%SRBC悬液用缓冲盐水稀释25倍，于分光光度计（542nm）测定透光率（以缓冲盐水校正透光率至100%）。每次实验用红细胞浓度（透光率）必须一致。4. 生理盐水5. 溶血素（anti-SRBC）：按说明书所标效价以缓冲盐水稀释至2单位。如效价为1：8000，使用时1：4000稀释。6. 致敏SRBC：2%SRBC加等量2单位溶血素，混匀，置37水浴10min。7. 50%溶血标准管：取2%SRBC悬液0.5ml，加入蒸馏水4.5ml，混匀。8. 37水浴箱9. 离心机10. 分光光度计11. 试管、吸管【方法】1. 取待检人血清0.2ml，加入缓冲盐水3.8ml，使成1：20稀释。2. 按下表所示加入各试剂，混匀，将试管置于37水浴30min。 表 CH50法测定总补体活性操作试管编号1：20稀释血清（ml）缓冲盐水（ml）致敏SRBC（ml）CH50（U/ml） 1 0.10 1.40 1.0 200 2 0.15 1.34 1.0 133 3 0.20 1.30 1.0 100 4 0.25 1.25 1.0 80 5 0.30 1.20 1.0 66.6 6 0.35 1.15 1.0 57.1 7 0.40 1.10 1.0 50 8 0.45 1.05 1.0 44.4 9 0.50 1.00 1.0 40 10 一 1.50 1.0 一【结果】将各试管2500rpm离心5min，取上清液与50%溶血标准管目视比较，观察溶血程度。取与50%溶血标准管相接近的两管在分光光度计上分别读取光密度值A542nm （0.5cm比色杯，以缓冲盐水作为空白调零），以最接近50%溶血标准管的一管，按下列公式计算CH50活性。 1 CH50（U/ml）= X 20（稀释倍数） 引起50%溶血管的血清量（ml） 本法测定的正常值范围为50-100 U/ml。【讨论】1. 操作注意事项（1） 待检血清标本应无溶血、无乳糜、无污染。（2） 缓冲液、致敏SRBC均应新鲜配制，缓冲液若被细菌污染，会导致自发溶血。（3） 待检血清标本必须新鲜，如室温放置2h以上，会使补体活性下降。（4） 实验所用玻璃器皿，一定要清洁，酸碱均能影响测定的准确性。（5） 测定需在0-4进行，试管需预冷，可保持补体活性。（6） 补体的溶血活性与反应时缓冲液的pH、离子强度、钙镁离子量、羊红细胞量、反应总体积及反应温度均有一定关系，因此实验时需对反应的各个环节做严格控制。2. 方法学评价（1） 本法简便快速，但敏感性较低，不能测定补体蛋白的绝对值。（2） 总补体活性的测定主要反映补体C1C9通过经典途径活化的程度。3. 临床意义（1） 在急性炎症、感染、组织损伤（如风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、伤寒、Reiter综合征和多发性结节炎）、癌肿、骨髓瘤等时，常可见补体含量增高。（2） 低补体血症多见于急性肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎、SLE活动期、RA