抗氧化活性.doc

-胡萝卜素漂白法测定莲子心粗多糖抗脂质过氧化的活性30 mL 试管中加入0. 5 mL-胡萝卜素(2caro2毛头牛蒡子醇提物抗氧化活性研究目的 研究毛头牛蒡子提取物的抗氧化活性。方法将毛头牛蒡子乙醇提取物采用溶剂萃取法, 分成极性不同的4 个部分, 并采用DPPH 法和邻苯三酚自氧化法测定各部分的清除DPPH 自由基和超氧阴离子自由基的能力, 以测定其抗氧化活性, 并与抗坏血酸进行比较DPPH 法抗氧化活性分析 DPPH 自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基, 在517 nm 处有强吸收, 其乙醇水溶液呈很深的蓝紫色, 加入受试物后,517 nm 处可以动态监测DPPH 自由基被清除的效果, 这种效果通常用对DPPH 的清除率来表示。清除率越大, DPPH 自由基清除越彻底, 受试物的抗氧化活性越强 67 。计算清除率的公式为: 其中, A0 为未加样DPPH 溶液的原始吸光度; A为加样后DPPH 液的吸光度; A 样为样品溶液自身的吸光度。公式中引入A0 是为了消除样品溶液本身颜色对实验结果的影响。A 0 的测定: 用移液器取2. 0 mL95% 乙醇, 再取2. 0 mL 已配制好的DPPH 溶液( 0. 2mmo l L- 1 ) , 充分振摇。稍后, 在517 nm 处测定吸光度,A 样的测定: 用微量移液管精密移取这4种样品溶液各10, 100, 200, 300, 400, 500 和600 uL, 加入95% 乙醇配成4 mL 的溶液, 混合, 振摇, 在517nm 处测定吸光度, 即A样。A 的测定: 用微量移液管精密移取样品溶液10, 100, 200, 300, 400, 500 和600uL, 各加入2. 0 mLDPPH 溶液( 0. 2 mmo l & L- 1 ) , 再加入95% 乙醇配成4 mL 的待测溶液, 混合, 充分振摇, 在37 度 水浴避光静置30 min, 在517 nm 处测定吸光度为A 。邻苯三酚自氧化法抗氧化活性分析 在14 号比色皿中分别加入3. 0 mL、pH 值为8. 2 的0. 05 mol L- 1( 含2 mmo l & L- 1 EDTA 溶液) 的Tris 溶液, 然后在1 号比色皿中加再0. 1 mL 样品溶剂, 在2 号比色皿中加入0. 1 mL 样品溶剂和0. 1 mL 0. 01 mol & L- 1的邻苯三酚溶液, 迅速摇匀, 以1 号比色皿调零测2号比色皿的吸光度A0 。在3 号中加入0. 1 mL 样品溶液和0. 1 mL 0. 01 mol & L- 1的盐酸溶液, 在4 号比色皿中加入0. 1 mL 样品溶液和0. 1 mL 0. 01 mol & L- 1的邻苯三酚溶液, 迅速摇匀, 以3 号比色皿溶液调零测4号比色皿溶液的吸光度A。式中A1 / t 为邻苯三酚自氧化速率, A2 / t 为加入抗氧化剂后邻苯三酚的反应速率半枝莲醇提工艺的优化及体外抗氧化活性评价的研究对DPPH 自由基的清除作用(2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay) 分别取5 L不同质量浓度的样品溶液加入245 L 0. 1 mmolL 1DPPH 甲醇溶液，并作空白对照(5 L 甲醇加入245L 0. 1 mmolL 1 DPPH 甲醇溶液) 和样品本底对照(5 L 不同浓度的样品溶液加入245 L 甲醇) ，在酶标仪上振荡混匀，静置30 min 后，于517 nm 处测量吸光度。以上试验重复操作3 次，根据下列公式计算每一浓度的样品溶液对DPPH 自由基的清除率(% ) :Ablank:空白对照的吸光度值;Asample:加样品溶液的吸光度值;Acontrol:样品本底对照的吸光度值。以样品溶液的浓度为横坐标，DPPH 自由基的清除率为纵坐标绘制标准曲线，根据回归的线性方程计算IC50值，即DPPH 自由基清除率为50% 时对应的样品溶液的质量浓度。，标准对照物质Trolox（;Trolox ( 6-hydroxy-2，5，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Sigma公司)）XOD活性评价买麻藤提取物抑制黄嘌呤氧化酶活性实验研究溶液配制 缓冲液： 取K2HPO43H20 1948g、KHzPO4199g，溶于500mL蒸馏水，配成02moL磷酸盐缓冲溶液(pH75)。酶溶液： 取黄嘌呤氧化酶5U， 用缓冲液稀释至100mL浓度为50UL，4C保存。底物溶液：取251mg黄嘌呤溶于250mL水得066mmol.L-1底物溶液。样品和阳性对照溶液：精密称取样品买麻藤水提物、买麻藤总芪提取物、白藜芦醇苷(作为阳性对照)分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到不同浓度的溶液使用时根据情况稀释(DMSO最终浓度1 )。酶活测定原理 黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化作用下生成尿酸产物尿酸在290nm处有特征吸收峰 以每分钟290nm 处吸光度的增加来计算酶活力。酶活性单位定义：在本实验条件下黄嘌呤氧化酶与黄嘌呤作用后每分钟催化1umol黄嘌呤转化为尿酸的酶量为1个活性单位(UL)。酶促反应米氏方程的绘制 实验体系中黄嘌呤采用350，875，17502625，3500umolL 5个浓度 黄嘌呤氧化酶浓度为50UL 。在试管中加入2mL不同浓度的黄嘌呤溶液25预温lOmin再加入经25预温的黄嘌呤氧化酶溶液lmL涡旋混匀在紫外290nm 处测定不同时间点反应体系的吸光度值，每分钟测定1次，连续测定15min，以时间与吸光度进行线形回归得各浓度黄嘌呤溶液的反应速度V 再以1/V对1S作图即反应速度和底物浓度的双倒数图绘制酶促反应米氏方程黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制实验酶活力测定 在试管中加入20mL底物溶液25 预温10min加入缓冲溶液01mL再加入经25预温的酶溶液10mL涡旋混匀用分光光度计测290nm处不同时间点反应体系的吸光度值每分钟测定1次，连续测定15min，以时间与吸光度进行线形回归，计算斜率Rate酶(dAmin)。每个样品平行操作3次取斜率平均值。样品测定 在试管中加入20mL底物溶液25预温10min加入不同浓度样品溶液01mL再加入经25预温的酶溶液10mL涡旋混匀同法测定吸光度值，以时间与吸光度进行线形回归计算斜率Rate样(dAmin)。24-3 空白对照 重复242步骤不加样品和XOD。但加01mL的DMSO 和10mL缓冲液记录吸光度的变化得Rate空白(dAmin)作为空白对照，计算抑制率时将它扣除。244 半数抑制浓度IC 的计算酶促反应中的药物浓度C：Cnx0131，C0是样品溶液浓度；抑制率I=(Rate酶一Rate样品)(Rate酶一Rate空白)x100 将药物浓度与抑制率进行回归得回归方程。根据方程计算抑制率I=50时C的值，即半数抑制浓度IC 。异叶蛇葡萄和蛇葡萄提取物抑制黄嘌呤氧化酶和脂质氧化酶的活性研究黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制试验底物溶液：分别取76、57、38 mg黄嘌呤溶解在500 ml水中，得到01、0075、005 mM的底物溶液，该溶液室温保存，可持续使用一周XOD 活力测定：XOD 的活力按照Cos等描述的方法在290 nm处用分光光度法测定。每隔20 sec在290 nm处记录吸光度增长的数值，共计5 min。根据不同时间吸光度增长的数值得到一条直线，计算直线的斜率。斜率越大，说明酶的活力越强样品测定：把植物提取物溶解在二甲亚砜(DMSO)中，得到不同浓度的溶液，取适量加到石英比色皿中(最终浓度1 )，重复上述操作、记录吸光度在290 nm处的变化。空白对照：重复上述操作，不加样品和XOD，但加与样品同样体积的DMSO，记录吸光度的变化，作为空白对照样品对XOD的抑制：通过上述样品测定获得直线的斜率减去空白，每个样品平行操作3次，分别计算直线的斜率，取斜率平均值计算样品的抑制系数，样品的抑制系数为斜率的倒数。抑制动力学常数Ki值的计算：使用3个不同浓度的底物(黄嘌呤)溶液，获得不同浓度样品溶液对XOD的抑制系数，用Dixon绘图法计算Ki值。阳性对照品：为了核对实验结果的可信性，取槲皮素溶解在二甲亚砜中得到不同浓度的溶液，重复上述实验，计算Kl值。中国南海海绵提取物renierol对黄嘌呤氧化酶的抑制作用利用超氧离子致NBT显色测定黄嘌呤氧化酶活性反应体系分为3组，其中模型组中加入黄嘌呤(50 umolL)、黄嘌呤氧化酶(01 Umo1)和NBT(50umolL)，而实验组中按样品renierol的浓度分别再在模型组的基础上加入20、40和60ugml的renierol，阳性对照组也在模型组基础上加入lugml的别嘌呤醇，反应体系中加入磷酸盐缓冲液(50mmolL ，pH值72)至终体积600uL。反应以加入黄嘌呤氧化酶为开始，室温反应5 min，用CE一2021分光光度计在560 nm下测定光密度，以每分钟的光密度增加量作为反应速度，将实验组和阳性对照组测得的光密度值除以模型组的光密度值算出其抑制率后加以比较。黄嘌呤溶解于l umolL NaOH，其他组分溶解于50 mmolI 磷酸盐缓冲液和01mmolL EDTA所配溶液邻苯三酚自氧化实验 将实验分为3组，即模型组、renierol样品组按其浓度再分为20、40和60ugml浓度组及阳性对照SOD(100 Um1)组。加入邻苯三酚前，先加入样品组和阳性对照组中的物质，于25 C恒温20 min后加入25 预热过的邻苯三酚，迅速摇匀，立即倾入光径l cm 比色杯中，在波长420 nm处测定光密度值D 中药提取物中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选溶液配制 缓冲液: 取K2HPO4、KH2PO4、EDTA2Na 溶于500 mL 水, 配成0. 2 mol/ L 缓冲溶液(pH7. 5) . 酶溶液: 取黄嘌呤氧化酶, 用缓冲液配成浓度为1. 144 units/ mL 的溶液. 测试过程中利用冰袋保持低温, 需每天配制. 底物溶液: 精密称取黄嘌呤溶于水, 制得0. 10 mmol/ L 和0. 05 mmol/ L 底物溶液, 室温保存. 样品和对照品溶液: 精密称取各样品及阳性对照品槲皮素, 分别用二甲基亚砜( DMSO)溶解, 得到不同浓度的溶液酶活力测定 在适宜条件下, 黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸, 产物尿酸290 nm 处有特征吸收峰, 因此以每分钟290 nm 处吸光度的增加来计算酶活力( dA/ min) ( dA 为吸光度的增加值) . 在任意一个适当长的时间段内, 吸光度随时间呈线性增加, 斜率为反应速率( dA/ min) , 斜率越大, 说明酶的活力越强。在石英比色皿中, 加入缓冲溶液、底物溶液、酶溶液, 测定290 nm 处吸光度增加值, 每隔0. 5 s记录一次, 共测1 min, 得到一条关于吸光度 时间的直线, 计算直线斜率Rate( dA/ min) .样品测定 按同样的方法, 在酶促反应体系中加入适量样品溶液, 每隔0. 5 s 记录290 nm处吸光度变化值, 共计1 min. 每个样品平行操作3 次, 取其平均值计算该样品的抑制率.1. 3. 4 空白对照 同上述操作, 加与样品同样体积的DMSO, 不加样品和XOD.1. 3. 5 XOD 对照品测定 方法与样品测定相同, 不加样品.1. 3. 6 阳性对照品 为核对实验方法与结果的可信性, 取已配制好的不同浓度的槲皮素溶液,重复上述实验, 计算IC50 值.抑制动力学常数K i 值的测定及计算 使用2 个不同浓度的黄嘌呤溶液, 获得不同浓度样品溶液对XOD 的反应速率, 用Dixon 绘图法计算K i 值结果与讨论2. 1 样品对XOD 的抑制率计算公式为 ( RpRs) / Rp 100%. 式中Rs、Rp 分别表示样品、XOD 对照品( 已减去空白对照) 的反应速率. 按照上述方法进行分析, 底物浓度为0. 10 mmol/ L, 样品浓度均为100 ug/ mL,槲皮素为10 ug/ ml迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用别嘌呤醇(allop urinol) 购自美国Sigma 公司;四唑硝基氮蓝(Nit ro Blue Btet razolium) 购自美国Sigma 公司测定尿酸生成1 mmol/ L 黄嘌呤溶液中加入20 、40 和60 g/ ml 的迷迭香酸或阳性对照别嘌呤醇(1g/ ml) ,加入0. 1 U/ ml 黄嘌呤氧化酶,反应体系中加入焦磷酸钠缓冲液(80 mmol/ L 、p H 值8. 5)至终体积1 ml ,反应以加入黄嘌呤氧化酶为开始,37 反应5 min ,在全自动生化分析仪(日立276002020) 测定尿酸生成量,以5 min 的尿酸生成量作为反应速度。1. 3 测定超氧离子生成1. 3. 1 NB T 显色反应反应体系中加入黄嘌呤(50mol/ L) 、黄嘌呤氧化酶(0. 1 U/ ml) 、NB T (50mol/ L) 和20 、40 和60 g/ ml 的迷迭香酸或阳性对照别嘌呤醇(1g/ ml) ,反应体系中加入磷酸盐缓冲液(50 mmol/ L ,p H 值7. 2) 至终体积600 l 。反应以加入黄嘌呤氧化酶为开始,室温反应5 min ,用CE22021 分光光度计在560 nm 下测定光密度( D560 ) ,波长560 nm ,以每分钟的光密度增加量作为反应速度。黄嘌呤溶解于1mol/ L NaOH ,其他组分溶解于50 mmol/ L 磷酸盐缓冲液和0. 1 mmol/ LEDTA 所配溶液一 DPPH消除能力操作流程：1） 样品组 样品20ul，DPPH 180ul（5105M）2） 阴性对照组：200ul DPPH3） 空白组：200ul水4） 阳性组：Vc 6组，分别为 120 60 30 15 ug/ml。维生素用水配制，不是用乙醇5） 将上述样品加好，避光摇 30min,测OD517nm备注：DPPH，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl ) 分子式:C18H12N5O6 分子量:394.32该品具有刺激性。吸入、口服或皮肤接触有害。用乙醇溶解配制公式：二 H2O2清除实验维生素配制：MW，176.13操作流程：1） 样品组：20ul 邻二氮菲（7.5mmol/L） 2)76ul PBS缓冲液（pH7.5）2） 30ul FeSO4(7.5mmol/L) 3)20ul样品3） 20ul0.01% 4)34ul水4） 损伤组：样品组不加样品 未损伤组：样品组不加样品和5） 将上述样品度静置h，测。公式：样品阳性损伤未损邻二氮菲20PBS7696116FeSO430水34样品20VC00H2O220037度静置1h，测OD536备注：邻二氮菲，即“1,10-邻二氮杂菲”，1,10-Phenanthroline monohydrate.也称邻菲罗啉、邻菲啰啉、邻菲咯啉，198.22是一种常用的氧化还原指示剂。邻二氮菲在pH为29时，会与亚铁离子（Fe2+）形成稳定的橙红色邻二氮菲亚铁离子（Fe(phen)32+），可通过分光光度法来分析。溶于乙醇、苯、丙酮，不溶于石油醚。与铁、铜、钴、镍和2,2-联吡啶形成配合物，与Fe2+形成红色配合物。该实验用乙醇配制。PBS缓冲液：PBS缓冲液 称取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO412H2O3.63g,KH2PO40.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。 PBST缓冲液 取300lTween-