Cytometric Bead Array（CBA）,即微量样本多指标流式蛋白定量.doc

Cytometric Bead Array（CBA）,即微量样本多指标流式蛋白定量技术是一个基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。日常实验中，常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测，如细胞培养上清或血清中的细胞因子含量的定量分析，由于这些因子的含量较少，低于一般常规方法的检测下限，使用常用的蛋白检测方法western Blot等很难检测。 BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性，只需使受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。为此，BD公司开发了的微量样本多指标流式蛋白定量系统，简称CBA系统，通过利用一系列带有荧光标记的微小、分散的微球连结特定的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物，通过对应各种不同检测物的特异微球上所带有荧光强度不同从而同时测定分析样本中多种可溶性成分的数量。BD的CBA系统的工作原理简单，对应受检系统中的每一个检测指标都设有不同的捕获微球，不同的捕获微球上包被有特异的捕获抗体，并具有不同的荧光强度，通过捕获微球与待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品（血清、血浆或细胞培养液）中的相应抗原或蛋白结合，最后，加入荧光的检测抗体以形成“三明治”夹心复合物，通过流式细胞样进行荧光检测，便可对样品中的各检测因子的含量进行分析。由于BD的CBA系统中每一个微球都能够提供一个和特定蛋白结合的表面，因此，每个微球就相当于一个单独的、包被好的ELISA板；相对于传统的ELISA技术，荧光信号显色的灵敏度比一般化学发光的灵敏度高，加上利用流式细胞仪对于荧光信号的高敏感性及放大作用，使用这种技术检测未知样品中的指标所需要的样品浓度更低，实验时间更短；另外，常规的ELISA操作，每次只能对一个样本中的一个指标进行检测，各检测子标间的操作需分开进行，往往造成珍贵样本的耗费，如病患者血液中向免疫调节细胞因子包括IFN-、TNF-、IL-2等，通过BD CBA系统，可同时对一个对样品中的多个指标进行检测，这为一些ELISA技术无法满足的实验提供了新的检测手段。现时，BD公司为了满足各种实验所需，符合各种要求的检测试剂盒逐渐增多，随着对CBA检测技术的不断完善，BD的CBA系统的使用者亦不断上升，为了方便BD的CBA系统使用，我们对CBA系统操作中一些常见问题及实验注意事项进行了总结，希望以下的总结，可使客户在以BD的CBA系统在开展实验时，能更有效、更准确、省时的完成实验。Q :我能不能使用Coulter XL去分析我的CBA数据？A : 虽然CBA试剂盒是为BD FACScan? 和 FACSCalibur? 流式细胞仪设计的，CBA试剂盒也可以通过Coulter XL细胞仪检测，CBA版本1.3以上的软件具有参数兼容性的特征，可以使用非BD公司的仪器分析实验数据，请参阅软件的用户使用指南或者联系技术支持得到进一步的信息。Q : 实验过程中，除了CBA的分析试剂盒，我们还需要准备什么？A : 除了试剂盒中所包含的成份外，若要进行CBA分析实验，还需要购买BD的微量样本多指标流式蛋白定量技术分析软件(cat. no. 0421CD/ 550065)，此软件主要是用于分析您的实验数据。虽然实验数据的分析可以不使用CBA的特定软件，但是，由于CBA实验中所采集的数据较为繁杂，若不通过专用的CBA软件进行分析，则进行数据分析的时间将显着增加。CBA的专用软件是建立在 Microsoft Excel 的基础上的，用户只需要完全安装MS Excel 98 或者Version 5.0即可安装CBA的专用软件。此外，用户还需要一个488纳米激光器及3个荧光参数的接收的流式细胞仪(eg: BD FACScan? or BD FACSCalibur? cytometer)。Q : CBA中使用的微珠是由什么做的？所使用到的微珠的平均半径是多少？A :CBA中使用的微珠的原料是聚苯乙烯，约为7.5?m。Q : 在CBA分析中我应该使用何种型号的试验管？A : 除了FACSArray外, 我们建议使用12x75 mm, 5 ml的聚苯乙烯管(BD Falcon Cat No. 352008)。Q :CBA分析中在进行标准曲线的配制时，有什么需要特别注意的地方？A : CBA试剂盒中所提供的标准样品是蛋白冻干粉，由于大部份的标准样品属细胞因子类的敏感型蛋白，在重悬标准样品成溶液或进行标准样品稀释时，不可采用振动混匀及剧烈吹打的方式处理标准样品，在重悬标准样品成溶液时，在加入溶液后，只需放于室温下平衡15 分钟即可。在进行标准样品的系列稀释时，只需轻轻吹打样品数次即可。否则，由于制成溶液后的标准样品不穏定，经剧烈混匀后易降解失活，影响实验中标准曲线的拟制。Q : 是不是每次实验都要使用一瓶新的标准品？A : 不管是标准品储备液 (x10)或实验中的稀释液中，标准品在配成溶液后不穏定，在配制成储备液 (x10) 的12小时后将不能再使用。在每次实验前都要重新配置新的标准品溶液。Q : 为什么振动混合微珠这个实验步骤如此关键？A : 在使用之前，微球必须充分的振动混合，从在微球混合液试管中加入另外一种微球之前，至微珠添加完毕后，直至在送到仪器进行上样检测之前，反应管都必须充分振动混合，这是由于充分的振动能够防止微珠聚集成团。若混合不足会导致在进行样品分析时候出现检测到很少或者没有检测到微珠的情况。因此在使用流式细胞仪分析标准品或者样品之前，必须充分振荡混合微珠。试验管在放置到流式细胞仪上检测前需要振荡混合3-5秒钟，这样在FL3通道里面能够更好的分辨出带有不同标志的微珠。Q :操作实验中，哪些步骤需要避光进行？为什么？A :凡涉及含捕获微球以检测抗体的相关步骤都需避光操作。这是由于CBA技术是使用R-藻红蛋白检测样品的荧光信号。由于使用R-藻红蛋白报告系统，可使获得CBA达到最佳敏感度的分析效果，因此每步添加了检测试剂后都要避光反应。此外，在加入检测试剂时，除了需避光操作外，还需严格遵守试剂盒的要求规范操作（比如：精确的加液），因为添加的微珠数量不准确会改变有效捕获面积从而影响检测的敏感性。Q : 我看不到FL2荧光信号或者看到的FL2荧光信号很弱，怎样解决这个问题？A : 检查样品的稀释度，不要随意的更改要求的孵育时间，在孵育过程中，保护样品试剂管不受到光照。Q : 实验中，在检测的时候我发现微珠聚集在一起，这是什么原因？A : 这可能是因为样品中的细胞因子的浓度太高了。此外，在实验前，请按试剂盒上的操作说明对流式细胞仪上各荧光补偿进行仔细调节，以确保所使用流式细胞仪参数是对应于操作的最优化设定。Q : 为什么在实验中我的实验结果背景很强/或者全部样品都显示高度的阳性？A : 实验结果背景很强可能是因为样品的浓度太高。请对您的样品,尤其是首次进行检测的体系，进行不同稀释度的检 小学常用歇后语1.八仙过海-各显神通 2.不入虎穴-焉得虎子3.蚕豆开花-黑心 4.车到山前-必有路5.打破砂锅-问到底 6.和尚打伞-无法无天7.虎落平阳-被犬欺 8.画蛇添足-多此一举9.箭在弦上-不得不发 10.井底青蛙-目光短浅11.大海捞针-没处寻 12.竹篮打水-一场空13.打开天窗-说亮话 14.船到桥头-自会直15.飞蛾扑火-自取灭亡 16.百米赛跑-分秒必争17.拔苗助长-急于求成 18.仇人相见-分外眼红19.芝麻开花-节节高 20.新官上任-三把火21.瞎子点灯-白费蜡 22.兔子尾巴-长不了23.偷鸡不成-蚀把米 24.王婆卖瓜-自卖自夸25.老虎屁股- 摸不得 26.老虎拉车-谁敢27.老鼠过街-人人喊打 28.麻雀虽小-五脏俱全29.墙上茅草-随风两边倒 30.三十六计-走为上计31.塞翁失马-焉知祸福 32.壶中无酒-难留客33.丈二和尚-摸不着头脑 34.有借有还-再借不难35.猫哭耗子-假慈悲 36.铰子破皮-露了馅37.扁担挑水-一心挂了两头 38.对牛弹琴-白费劲39.八仙聚会-神聊 40.霸王敬酒-不干也得干41.板上订钉-跑不了 42.背鼓上门-讨打43.草把做灯-粗心（芯） 44.竹笋出土-节节高45.菜刀切豆腐-两面光 46.钉头碰钉子-硬碰硬47.高山上敲鼓-四面闻名（鸣） 48.铁打的公鸡-一毛不拔49.关公走麦城-骄必败 50.狗咬吕洞宾-不识好人心51.鸡蛋碰石头-不自量力 52.姜太公钓鱼-愿者上钩53.脚踏西瓜皮-滑到哪里是哪里 54.孔夫子搬家-净是书55.老鼠钻风箱-两头受气 56.留得青山在-不怕没柴烧57.门缝里看人-把人看扁了 58.泥菩萨过河-自身难保59.泼出去的水-收不回 60.骑驴看唱本-走着瞧61.千里送鹅毛-礼轻情意重 62.肉包子打狗-有去无回63.山中无老虎-猴子称大王 64.司马昭之心-路人皆知65.外甥打灯笼-照旧（舅） 66.王八吃年糕-铁了心67.王小二过年-一年不如一年 68.小葱拌豆腐-一清二白69.小和尚念经-有口无心 70.周瑜打黄盖-两厢情愿71.赶鸭子上架-吃力不讨好 72.擀面杖吹火- -一窍不通73.瞎子戴眼镜-装饰 74.猴子捞月亮-空忙一场75.秀才遇到兵-有理讲不清 76.三个臭皮匠-顶个诸葛亮77.黄牛追兔子-有劲使不上 78.和尚训道士-管得宽79.过年娶媳妇-双喜临门 80.聋子见哑巴-不闻不问六字短语81.铜钣上钉铆钉-一是一，二是二 82.里弄里扛竹竿-直来直去83.苦水里泡黄连-苦上加苦 84.驴唇不对马嘴-答非所问85.猪鼻子里插葱-装象 86.只许州官放火-不许百姓点灯87.猪八戒照镜子-里外不是人 88.放风筝断了线-没指望了89.池塘里的风波-大不了 90.关门掩着耗子-急（挤）死91.顶风顶水划船-硬撑 92.东北的二人转-一唱一和93.东洋人戴高帽-假充大个 94.到火神庙求雨-找错了门95.鲁班门前耍斧-有眼无珠 96.老太太吃汤圆-囫囵 吞97.出太阳下暴雨-假情（晴） 98.挂羊头卖狗肉-虚情假意99.担着胡子过河-谦虚过度 100.唱歌不看曲本-离谱小学常用歇后语1.八仙过海-各显神通 2.不入虎穴-焉得虎子3.蚕豆开花-黑心 4.车到山前-必有路5.打破砂锅-问到底 6.和尚打伞-无法无天7.虎落平阳-被犬欺 8.画蛇添足-多此一举9.箭在弦上-不得不发 10.井底青蛙-目光短浅11.大海捞针-没处寻 12.竹篮打水-一场空13.打开天窗-说亮话 14.船到桥头-自会直15.飞蛾扑火-自取灭亡 16.百米赛跑-分秒必争17.拔苗助长-急于求成 18.仇人相见-分外眼红19.芝麻开花-节节高 20.新官上任-三把火21.瞎子点灯-白费蜡 22.兔子尾巴-长不了23.偷鸡不成-蚀把米 24.王婆卖瓜-自卖自夸25.老虎屁股- 摸不得 26.老虎拉车-谁敢27.老鼠过街-人人喊打 28.麻雀虽小-五脏俱全29.墙上茅草-随风两边倒 30.三十六计-走为上计31.塞翁失马-焉知祸福 32.壶中无酒-难留客33.丈二和尚-摸不着头脑 34.有借有还-再借不难35.猫哭耗子-假慈悲 36.铰子破皮-露了馅37.扁担挑水-一心挂了两头 38.对牛弹琴-白费劲39.八仙聚会-神聊 40.霸王敬酒-不干也得干41.板上订钉-跑不了 42.背鼓上门-讨打43.草把做灯-粗心（芯） 44.竹笋出土-节节高45.菜刀切豆腐-两面光 46.钉头碰钉子-硬碰硬47.高山上敲鼓-四面闻名（鸣） 48.铁打的公鸡-一毛不拔49.关公走麦城-骄必败 50.狗咬吕洞宾-不识好人心51.鸡蛋碰石头-不自量力 52.姜太公钓鱼-愿者上钩53.脚踏西瓜皮-滑到哪里是哪里 54.孔夫子搬家-净是书55.老鼠钻风箱-两头受气 56.留得青山在-不怕没柴烧57.门缝里看人-把人看扁了 58.泥菩萨过河-自身难保59.泼出去的水-收不回 60.骑驴看唱本-走着瞧61.千里送鹅毛-礼轻情意重 62.肉包子打狗-有去无回63.山中无老虎-猴子称大王 64.司马昭之心-路人皆知65.外甥打灯笼-照旧（舅） 66.王八吃年糕-铁了心67.王小二过年-一年不如一年 68.小葱拌豆腐-一清二白69.小和尚念经-有口无心 70.周瑜打黄盖-两厢情愿71.赶鸭子上架-吃力不讨好 72.擀面杖吹火- -一窍不通73.瞎子戴眼镜-装饰 74.猴子捞月亮-空忙一场75.秀才遇到兵-有理讲不清 76.三个臭皮匠-顶个诸葛亮77.黄牛追兔子-有劲使不上 78.和尚训道士-管得宽79.过年娶媳妇-双喜临门 80.聋子见哑巴-不闻不问六字短语81.铜钣上钉铆钉-一是一，二是二 82.里弄里扛竹竿-直来直去83.苦水里泡黄连-苦上加苦 84.驴唇不对马嘴-答非所问85.猪鼻子里插葱-装象 86.只许州官放火-不许百姓点灯87.猪八戒照镜子-里外不是人 88.放风筝断了线-没指望了89.池塘里的风波-大不了 90.关门掩着耗子-急（挤）死91.顶风顶水划船-硬撑 92.东北的二人转-一唱一和93.东洋人戴高帽-假充大个 94.到火神庙求雨-找错了门95.鲁班门前耍斧-有眼无珠 96.老太太吃汤圆-囫囵 吞97.出太阳下暴雨-假情（晴） 98.挂羊头卖狗肉-虚情假意99.担着胡子过河-谦虚过度 100.唱歌不看曲本-离谱测。如果所有样品都显示阳性或者高于标准品的最高浓度读数，这时候请对您的样品进行进一步的稀释，因为您的样品的浓度已高于本系统的正常检测范围。Q : 为什么在实验中会出现看到微珠碎片和没有看到微珠的情况？A : 如果在样品分析的时候在FSC/SSC的检测图中出现碎片，上调SSC的阈值C或者同时上调FSC和SSC的双阈值。如果在调整SSC的阈值以后问题依然存在，请重复样品的洗涤步骤或者再次稀释样品。Q: CBA的检测结果是否可直接与ELISA的分析结果进行对比?A: 不可。因为CBA是基于荧光的报告系统实现的，虽然CBA系统相对于ELISA分析具有良