ATG4C基因的提取与转入.ppt

姓名 学号 综合创新性实验报告 磷酸化自噬相关蛋白4C抗体phgophs ATG4C基因与载体的连接与转化 Macroautophagy 自噬 是主要的细胞内蛋白质的降解途径对长寿和细胞器 此外 异常的自噬中发挥作用的主要健康问题包括癌症和神经退行性疾病 ATG4C是一种与自噬有关的抗体蛋白 人体中它有458个氨基酸组成 在2007年马利尼奥发现它具有抑制癌细胞的作用 Mari oG Salvador MontoliuN FueyoA KnechtE MizushimaN L pez Ot nC JBiolChem 2007Jun22 282 25 18573 83 Epub2007Apr17 Tissue specificautophagyalterationsandincreasedtumorigenesisinmicedeficientinAtg4C autophagin 3 1 实验仪器 电子天平 纯水系统 离心机 高压蒸汽灭菌器 台式离心机 70 低温冰箱 微量移液器 高速冷冻离心机超净工作台 电热恒温水浴箱 电泳槽 紫外 可见分光光度计 电泳仪 凝胶图像分析仪 细菌培养箱 自动台式灭菌器 恒温空气浴振荡器 UV投射仪 2 实验试剂 pSilencer1 0 U6质粒 大肠杆菌JM109 T4DNA连接酶 小量质粒提取试剂盒 限制性内切酶 BamH Hind 10 T4DNA连接酶缓冲液 无核酶水 75 的冰冻乙醇 氯仿 三氯甲烷 异丙醇 RNasefreedH2O 去RNA酶的水 无Ca2 Mg2 Hank s液 含10 20 灭活小牛血清Hank s液引物的获取Atg4C的基因序列编号为 ENST00000317868 本实验研究其较长的ccDNA中的部分基因 试验中扩增445至976共532bp 其引物信息为 正链引物 TGGACTTCCCACACTGTCAAAG C 47 62 Tm 55 64 负链引物 TGCCACCAATAATACCCACACG C 47 62 Tm 54 52 实验仪器和试剂 3 实验研究方案 1 外周血白细胞的分离人外周血红细胞与白细胞的比例约为6000 1000 1 两类细胞的沉降速度不同 据此加以分离 自然沉降法是利用红细胞自然沉降率较快加以分离 该法简便易行 对细胞损伤少 但纯度差 试剂及配制 1 无Ca2 Mg2 Hank s液 2 含10 20 灭活小牛血清Hank s液 操作方法 1 取静脉血2ml 放入加有抗凝剂的试管中 轻轻混匀 2 将试管直立静置于室温或37 温箱中30 60min 待红细胞自然沉降 此时可见试管中的悬液分3层 上层为淡黄色血浆 底层为红细胞 在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层 3 用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液 移入另一试管中 4 加入无Ca2 Mg2 Hank s液至离试管口3cm处 混匀 以水平离心机2000r min离心10min 弃上清 同法在洗涤两次 5 沉淀细胞用适量10 20 灭活小牛血清的Hank s液重悬 计数 配成所需的细胞浓度的悬液 一般常用2 106 min 2 RNA提取1ml外周血中加入3ml红细胞裂解液 颠倒混匀 室温放置5min 3000rpm离心5min 弃上清 留下白细胞沉淀 或者1 1的比例裂解 重复三次 加入1mlTrizol裂解白细胞 用枪将其移至EP管中反复吹打至完全分散 用5ml注射器反复吹打 不少于10次 再用1ml注射器反复吹打 加入1 5总体积的氯仿 200ul 颠倒混匀 室温放置5min 4 离心 12000rpm15min 转上层水相450ul于另一个EP管中 加入等体积的异丙醇 混匀 静置15min 4 离心 12000rpm10min 弃上清 加入预冷的75 乙醇 800 1000ml 4 离心 7500rpm5min 弃上清 将EP管倒置于吸收纸上 室温放置风干 将RNA重新溶于30ul 或者20ul 水中 80 冰箱保存 备用1 取5ulRNA进行琼脂糖凝胶电泳 使用DEPC水配置 2 取1 2ul总RNA进行浓度以及纯度测定 RNA反转录成cDNA1 在灭菌0 1 DEPC浸泡过夜的1 5ml离心管中配制下列混合液OligodTPrimer 50uM 1uldNTPmixture 10mMeach 1ulRNA模板0 5ug 5ug 根据说明书要求以及RNA浓度计算得到 RNaseFreedH2O适量至总体积为10ul2 65 保温5min后 冰上迅速冷却1min以上3 在上述离心管中继续配制下列反应液 总量为20ul上述变性后反应液10ul5XPrimeScriptIIBuffer4ulRNaseInhibitor 40U ul 0 5ulPrimeScriptIIRTase 200U ul 1ulRNaseFreedH2O至20ul4 缓慢混匀 轻轻用枪吹打或手指轻弹 稍离心5 42 30 60min6 70 灭活15min后 冰上迅速冷却 PCR实验 25ul反应体系 Taqmix12 5ul引物1 上游 10 20nM 0 5ul引物2 下游 10 20nM 0 5ulcDNA2ul 可调整 超纯水加至总体积25ulPCR步骤 1 Holdon94 5min2 Cycle94 40s3 退火温度 X 40s4 72 40srepeat 2 4步骤 5 72 10min6 4 60min琼脂糖凝胶电泳1 1 5g 根据PCR产物片段大小 琼脂糖溶于100ml1XTBE中 微波炉3min后冷却至60 70 左右加入5ulEB溶液 2 待凝胶凝固后移至电泳槽中 负极为上样孔位置 约10ul 孔3 电压100V50min 根据分子大小 4 紫外透射仪上初步观察条带 并使用凝胶成像分析仪拍照储存 西南大学物理科学与技术学院2004级物理学3班hzx 目的基因与克隆载体的体外重组1 用限制性内切酶消化质粒与目的基因2 苯酚 氯仿抽提及乙醇沉淀法纯化被消化的外源性DNA片段和载体DNA 3 TE重新溶解纯化出的两份DNA沉淀 分光光度计测定DNA浓度 4 用微量进样器分别吸取各溶液于3支EP管中 5 连接反应混合物置于16摄氏度过夜重组克隆载体引入受体细胞1 用冷却的无菌吸头从每份用CaCl2溶液制备的感受态细胞悬液中吸取100微升转移到3个0 5ml无菌离心管中 每管加入上述的链接物 轻轻混匀 冰浴30分钟2 将装有感受态细胞和链接物的离心管放入预加温至42摄氏度的水浴锅中90s3 快速将离心管转移至冰浴中 使细胞冷却2min 4 每管加入900微升的LB培养基 水浴将温度加至37摄氏度 然后转移至摇床 使细胞复苏并表达质粒编码的抗性基因 含目的基因重组载体的筛选 鉴定与分析筛选1 取200微升已转化的感受态细胞接种到预加青霉素的LB培养基平板上 2 将平板底朝下平放于温室下至液体被吸收 3 将平板倒置于恒温培养箱中 37摄氏度培养12 16h后观察菌落生长情况 鉴定采用酶切及凝胶电泳法对培养平板上生长的菌落进行鉴定 步骤如下 1