纤维素酶基因重组乳酸菌的优化培养.doc

河 南 科 技 大 学毕 业 论 文 纤维素酶基因重组乳酸菌的优化培养THE OPTIMAL CULTURE OF CELLULASE GENE RECOMBINED LACTIC ACID BACTERIA 姓 名 武洪志 院 系 动物科技学院 专 业 动物科学 指导教师 李旺博士 2011年6月1日毕 业 设 计（ 论 文 ）任 务 书（指导教师填表） 填表时间：2011年1月10日学生姓名武洪志专业班级动科071指导教师李旺课题类型论文设计（论文）题目纤维素酶基因重组乳酸菌的优化培养主要研究内容1.采用逐步确定单一变量的设计和正交实验设计，将有可能影响到重组乳酸菌生长和纤维素酶基因表达的培养基成分（碳源、氮源、盐浓度等），培养条件（温度、需氧厌氧、时间，pH值等）分别进行优化，计算优化前后细菌的生长速度，纤维素酶活力的变化。2.确定重组乳酸菌最佳培养条件。主要技术指标(或研究目标)1.通过本研究，对影响到重组乳酸菌生长和外源纤维素酶基因表达的条件进行优化，以确定其最佳的生长条件和产酶条件。2.本项试验查阅20篇以上与本题有关的文献资料；撰写不少于1万字的论文；中文摘要400字以上，且译成外文；独立完成1万字以上印刷字符与本题有关的外语译文。进度计划2011年1月 查找资料 2011年2月 撰写开题报告2011年35月上旬 调查测定结果，分析数据 2011年5月中下旬 撰写论文 2011年6月初 论文答辩主要参考文献1.孙军德，刘先.高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养条件优化. 沈阳农业大学学报, 2010,(01), 90-932.王鹏飞，吴阳，卜宁等.畜禽粪水中乳酸菌的分离及其培养条件的研究. 科技信息, 2010,(02), 132-1333.林伟涛，徐世明，吕家森等.中式发酵干香肠中乳酸菌的分离筛选、鉴定和培养.食品工业科技, 2010,(01), 194-197教研室主任签字： 年 月 日纤维素酶基因重组乳酸菌的优化培养摘 要纤维素酶基因重组乳酸菌是通过分子生物学的手段在野生型乳酸菌基因组中整合入纤维素酶基因的一组重组菌，本试验通过采用逐步确定单一变量和正交试验相结合的设计，对影响重组菌生长的条件（碳源、氮源、酸碱度、培养时间、有氧无氧）进行优化，来确定其最佳的生长条件及最佳的产纤维素酶的条件。通过试验，最终确定其最佳生长培养基成分为：蔗糖 10g，蛋白胨 10g，牛肉膏 10g，酵母浸出物 5g，吐温 80 1ml，柠檬酸二铵 2g，CH3COONa3H2O 5g，磷酸氢二钾 2g，盐液甲 5.0ml，蒸馏水 1000ml；最佳生长环境为：pH为2.06.4，其中3.0最佳，培养温度为37， 培养时间为26h，厌氧培养，此时纤维素酶重组乳酸菌的OD600值达到1.002。同时，对每次优化培养的乳酸菌发酵液通过测定纤维素酶活力来确定该重组菌的最佳产酶条件。试验结果为：37在乳酸菌选择培养基（MRS培养基）中厌氧培养26h，此时的酶活力达到0.258U/ml。本试验采用的逐步确定单一变量的设计对正交实验设计中的不足起到了弥补的作用，两种设计最终所得到的实验结果基本一致。通过本试验，初步对纤维素酶重组乳酸菌的生长条件和产酶条件进行探讨，为培养纤维素酶基因重组乳酸菌和生产纤维素酶做准备。关键词：纤维素酶；基因重组乳酸菌，优化，最佳生长状况，产纤维素酶状况培养THE OPTIMAL CULTURE OF CELLULASE GENE RECOMBINED LACTIC ACID BACTERIAABSTRACT Cellulase gene recombined lactic acid bacteria is a recombined germ, which is integrated the cellulase gene to the genome of wild type lactic acid bacteria by molecular biology, this study used the design of orthogonal test and of gradually determine single variable, through the optimal culture of the influencing vegetal terms of recombined germ, such as carbon source, nitrogen source, power of hydrogen, cultivating time, oxygen condition and so on , to find the topgallant growth condition and producing celluase of the recombined germ.Through the experiment, the topgallant medium components come out with cane suger 10g, tryptone 10g , beef extract 10g, yeast extract 5.0ml, diammonium citrate 2g, sodium acetate 5g, salt liquid nail 5.0ml, distilled water 1000ml; and the topgallant growth environment were no oxygen, pH for 2.0 to 6.4 were all adapted, but the topgallant was 3.0, cultivation was carried out at 37for 26 h without oxygen, and at this time, the OD600 of cellulase gene recombined lactic acid bacteria was 1.002. Meanwhile, find out the the topgallant produce cellulase condition by assaying the celluase enzymic activity of fermenting liquor of the optimal culture of lactic acid bacteria. And the enzymic activity was 0.258U/ml when cultured the lactic acid bacteria without oxygen at 37for 26h on MRS medium. The design for gradually determine single variable of this study can make up the deficiency of the orthogonal design, and the experimental result of two designs come to basal coincidence. this study can initial investigate the growth congdition and producing cellulose condition of cellulase genetic recombination lactic acid bacteria and gets ready for culturing cellulase gene recombined lactic acid bacteria and producing cellulose. KEY WORDS: cellulase gene recombined l；Lactic acid bacteria, optimal culture, the topgallant growth condition,produce cellulase condition目 录1 前言11.1乳酸菌的概述11.2 纤维素酶的概述31.3 国内外的研究进展41.4 本实验研究的目的及意义52 材料与方法62.1 材料62.2 实验方法62.3 数据处理113 实验结果113.1 葡萄糖标准曲线的绘制113.2 单因素确定的结果123.3 正交实验设计的结果及处理：184 讨论195 结论19参考文献21致 谢23外文资料译文：24291 前言1.1乳酸菌的概述1.1.1 乳酸菌的简介乳酸菌指能够发酵糖类产生乳酸的细菌的总称，该类细菌无芽孢，革兰氏染色为阳性1。乳酸菌是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种2。乳酸菌菌体常排列成链。根据乳酸菌的形状分为乳酸球菌和乳酸杆菌，常见的乳球菌如乳酸链球菌族，菌体球状，通常成对或成链。乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝3。在乳酸菌家族中，除极少数外，其中绝大部分都是对人及动物体生长和健康具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人及动物体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。 对人和动物来讲，乳酸菌是一种益生菌。乳酸菌能够产生乳酸，降低肠道pH,同时乳酸菌能够分泌乳酸菌素，能够在一定程度上杀灭肠道致病微生物。同时，作为益生菌的乳酸杆菌能够帮助食物消化，有助于人及动物体健康，因此常被视为健康食品，添加在部分人及动物的食物之内4。1.1.2 乳酸菌的功能及生产应用乳酸菌从某种角度来讲可以说是人和动物体内的“活宝”。其生物功能主要有以下几方面5,19：可以很好的防治部分个体患有的乳糖不耐症（喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状）。可以促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质。 可以使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人及动物体胃肠道功能，恢复人及动物体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人及动物体健康。可以抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾。 可以抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用。 具有免疫调节作用，增强人及动物体免疫力和抵抗力。 具有抗肿瘤、预防癌症的作用。 可以提高SOD酶活力，消除人及动物体自由基，具抗衰老、延年益寿作用。 能有效预防雌性泌尿生殖系统细菌感染。 可以控制人及动物体内毒素水平，保护肝脏并增强肝脏的解毒、排毒功能。鉴于乳酸菌的以上功能，乳酸菌已被广泛应用于人及动物生产的各个领域6,7。在动物饲养方面16：养殖业长期使用抗生素使细菌产生耐药性，引起畜禽体内菌群失调和二重感染，使畜禽免疫力下降，并在动物产品及环境中残留，同时滥用抗生素加大了饲料的成本，降低了经济效益，针对长期使用抗生素添加剂所造成的诸多弊端，研究开发替代抗生素的绿色饲料添加剂具有重要的意义。乳酸菌制剂是饲用微生物添加剂中应用最为广泛，效果较好的一类益生菌制剂。乳酸菌可以在动物肠道内大量定植，帮助食物消化和代谢，促进营养物质的吸收和利用；同时它还能与致病菌竞争，抑制有害菌的繁殖，改善肠道内环境，调整肠道菌群平衡，提高动物健康水平。在养猪生产中，应用乳酸菌制剂可以达到提高日增重，改善料肉比，增强机体抗病力，提高成活率，降低腹泻率，提高经济效益的效果。在医药方面：伽马氨基丁酸（GABA）是广泛存在于自然界的一种非蛋白的氨基酸，其在哺乳动物体内相当于一种神经传导物质，该物质已被提取并已成为降血压的药物原料。动物实验证明，乳酸菌抽提物具有降血压的功效，但生产乳酸菌抽提物的成本极高，不能普及。各种蛋白质中都含有谷氨酸，最经济适用的方法是以乳品为原料，因为乳品中乳蛋白含谷氨酸最多，可达20%。可用乳酸菌将乳蛋白中的谷氨酸转化成GABA。研究从200种乳酸菌中筛选出有优先使乳蛋白中谷氨酸游离的高活性蛋白酶，同时有将谷氨酸再转化为GABA的高活性脱羧酶的乳酸菌。在生产中控制好转化时所需的pH值和温度，就可高效率的将乳蛋白中的谷氨酸转化为GABA。在肉品防腐保鲜方面16：肉品安全在食品安全中占有重要地位，传统的肉品保鲜是应用食品添加剂、包装、辐照、冷冻、熏烤、腌制等技术来延长货架期。但以上各种方式或多或少都会给肉品的安全带来负面影响，不能达到理想的目的。寻找广谱、高效、低毒、天然的食品防腐保鲜剂是目前研究的热点，乳酸菌以其独特的优越性被关注并作为生物防腐剂应用在食品保鲜中。乳酸链球菌分泌产生Nisin（乳酸链球菌素），它对动物没有毒性作用，已经被美国FAD批准认可应用于食品中，来控制容易引起食物性疾病的微生物。肉品的腐败主要由于蛋白质的分解，腐败降低了肉制品的食用价值和营养价值，危害消费者的健康。乳酸菌在发酵的过程中产生的代谢产物如有机酸、丁二酮、过氧化氢等具有一定杀菌作用并使pH值下降，有些乳酸菌可以分泌乳酸菌素，能够杀死食品中其他种类的革兰氏阳性菌25。另外，乳酸菌在肉品的加工、运输等方面也有积极重要的应用22。1.1.3 对乳酸菌的研究历史早在20世纪初，俄国著名的生物学家梅契尼柯夫，在他获得诺贝尔奖的“长寿学说”7,8里已明确指出，保加利亚的巴尔干岛地区居民，日常生活中经常饮用的酸奶中含有大量的乳酸菌，这些乳酸菌能够定植在人体内，有效地抑制有害菌的生长，减少由于肠道内有害菌产生的毒素对整个机体的毒害，这是保加利亚地区居民长寿的重要原因19。这个具有划时代意义的“长寿学说”，为人类利用乳酸菌生产健康食品开创了新纪元。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌。到目前为止，人类日常食用的泡菜、酸奶、酱油、豆豉等，都是应用乳酸菌这种原始而简单的随机天然发酵的代谢产物18,20,21。1.2 纤维素酶的概述1.2.1 纤维素酶的简介纤维素酶是能够分解纤维素产生葡萄糖的一类酶，主要由外切-葡聚糖酶、内切-葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力5。纤维素酶广泛存在于自然界的微生物（如细菌，真菌）、植物和动物体内。它在分解纤维素时三个酶共同作用，对纤维素进行水解作用6。1.2.2 纤维素酶的组成与功能纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶-葡聚糖苷酶（-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工业中主要应用来源于真菌的纤维素酶。1.2.3 纤维素酶降解纤维素的机理研究纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖9。 1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖10。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖11。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。1.2.4 纤维素酶在生产实际中的应用纤维素酶由于其自身的特性，在人类生活以及动物的生产中有着非常广泛的应用13。饲料领域：在瘤胃微生物区系结构正常的情况下，添加纤维素酶能以几倍的效率提高纤维和其他营养物质的降解强度，提高消化吸收水平。在瘤胃发生病理变化即微生物区系失去平衡进入腐解过程中时，高活性纤维素酶能迅速调整微生物区系结构，恢复平衡关系和正常酵解、吸收、合成过程。在蛋鸡常规饲料中添加0.1%的复合纤维素酶，蛋鸡的产蛋率可提高10.8%，蛋重提高1.7%，料蛋比下降14.2%。用纤维素酶添加日粮饲喂蛋鸡，对蛋形指数、蛋壳厚度虽不能产生明显的影响，但能显著降低破蛋率35。 食品领域：在进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精和白酒的出酒率及原料的利用率，降低溶液的粘度，缩短发酵时间，而且酒的口感醇香，杂醇油含量低。将纤维素酶应用于啤酒工业麦芽生产中可增加麦粒溶解性，加快发芽，减少糖化液中单一葡萄糖含量，改进过滤性能，有利于酒精蒸馏。在酱油的酿造过程中添加纤维素酶，可使大豆类原料的细胞膜膨胀软化破坏，使包藏在细胞中的蛋白质和碳水化合物释放，这样可提高酱油的浓度，改善酱油质量，又可缩短生产周期，提高生产率，并使各项指标均提高3%。纺织领域：纤维素酶在染整上广泛应用，特别在棉织物整理上，经过纤维素酶整理后，棉织物的手感和外观获得很大的改善。纤维素酶应用于牛仔服装的洗涤整理，可获得与石墨相同的染料脱色、洗白等褪色防旧效果。另外纤维素酶在造纸业上也有重要的应用。1.3 国内外的研究进展 确定重组乳酸菌的最佳生长条件及产酶条件对我们利用乳酸菌时使其发挥最大潜能有重要的意义17。随着生物技术的发展，国内外类似的且具有实用价值的研究也越来越多。孙君社、李雪、董秀芹（2002）以康氏木霉TR为出发菌株，经过紫外线诱变，结合双层平板分离技术选育出1株纤维素酶活力明显提高的菌株TR6并通过对康氏木霉固体发酵培养基、接种量、氮源、培养时间和培养温度等培养条件的研究，通过测定其所产纤维素酶的CMA和FPA酶活，找到了最佳的产酶条件32；王鹏飞、吴阳、卜宁、陶思源（2010）确定乳酸菌株最佳生长温度范围是2528，以27最佳；最适pH值范围为4.57.0；耐盐性强，在4NaCl浓度该菌也能良好生长。通过正交实验确定其最佳培养基配方为：蔗糖10g，酵母膏5g，牛肉膏6g，乙酸钠5g，MgS047H2O 5g，柠檬酸三钠2g，水1000ml，PH自然2；王迎华、曹郁生、陈燕、高丹丹从实验室保存及市售泡菜和发酵乳中分离的乳酸茵中进行筛选，通过黏度和EPS产量的测定，筛选出一株高产EPS的乳酸菌33；孙军德，刘先(2010)从酸菜汁和酸奶中筛选出一株高产胞外多糖的乳酸菌L3,应用苯酚一硫酸比色法测定其胞外多糖的产量26,分别改变基础培养基的碳源、氮源、发酵温度、时间、pH等条件，探索其对乳酸菌L3胞外多糖生物合成能力的影响,结果表明：葡萄糖和蛋白胨分别是乳酸菌产生多糖的良好碳源和氮源,该菌株胞外多糖的最佳生物合成条件为：初始pH值6.5，发酵温度37，发酵时间24h，此条件下胞外多糖的生物合成量为108.49mg/L34。闫征、王昌禄、顾晓波（2003）研究了分别用HCl 和乳酸调节培养基初始pH 以及在发酵过程中加入不同的酸中和剂对乳酸菌生长和乳酸产量的影响,结果表明，终产物乳酸的积累是抑制乳酸菌生长和导致乳酸产量下降的直接原因，该情况随发酵液中氢离子浓度的升高（即p的降低）而增强，氢离子的积累对菌体生长和产酸的影响是间接的；用碳酸钙调节发酵液氢氧化钠和氢氧化铵31。在西方国家中，乳酸菌在奶制品中的应用相当广泛，欧洲发酵乳酸菌奶饮料在乳制品市场的比例已达到80，北美约为3015。纤维素酶从被发现起就受到世界各国生物界的关注36。当今世界 ,纤维素酶的应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、废水处理及饲料等各个领域 , 美国乔治亚大学、佛罗里达大学的高温热纤梭菌的厌氧酒精发酵研究己取得阶段性成果32。另外，利用基因操作技术把纤维素酶基因克隆在S.Cerevisiae及z.mo lis中，使得它们能够利用纤维素直接转化生产酒精，该工作也取得进展39,40。同样，日本现已完成由蔗渣、稻草为原料生产燃料酒精的中试，日耗原料720kg，产酒精150L-200L，酒精度为99. 5%vo130,31。其它一些国家如法国等也制定了发展规划，从而在世界范围内使得该分支领域成为纤维素酶研究中最为活跃并有希望取得重大突破的分支之一。由上可见，乳酸菌和纤维素酶的应用具有广泛的前景，同时我们也看到了国内在此方面的不足，也便使乳酸菌和纤维素酶的开发和应用具有更大的空间。1.4 本实验研究的目的及意义乳酸菌是一种自然界中广泛存在，对人及动物有益的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，对人和动物有免疫和保健功能，很多乳酸菌通过活菌制剂的形式作为饲料添加剂和食品添加剂使用。纤维素酶是一种广泛存在于自然界生物体中的复合酶，其能将占植物光合作用产生的干物质50%的纤维素分解成葡萄糖。在前期的工作中，通过基因工程使纤维素酶基因整合到乳酸菌基因组中，构建了一株纤维素酶基因重组乳酸菌。本实验中对纤维素酶基因重组乳酸菌进行优化培养，通过试验设计确定其最佳的生长条件和最佳的产纤维素酶的条件。为将来大规模该重组菌的培养奠定了基础。同时，通过本试验，初步对纤维素酶重组乳酸菌的产酶条件进行过探讨，为培养纤维素酶基因重组乳酸菌和生产纤维素酶做准备。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 实验菌株纤维素酶基因重组乳酸菌（由前期工作构建，纤维素酶基因来源于枯草芽孢杆菌，宿主乳酸菌分离于鸡小肠）。2.1.2 实验试剂36TRYPTONE,，YEAST EXTRACT, LACTALBUMIN HYDROLYSATE，磷酸二氢钾，枸橼酸二铵，氯化铵，AGAR，蔗糖,羧甲基纤维素钠,牛肉浸膏，麦芽糖，冰乙酸，三水乙酸钠，氢氧化钠，葡糖糖，3,5-二硝基水杨酸，四水酒石酸钾钠，五水亚硫酸钠，重蒸酚，七水硫酸镁，四水硫酸锰，吐温 80，蒸馏水。其中TRYPTONE，YEAST EXTRACT，LACTALBUMIN HYDROLYSATE，AGAR均购自英国OXOID公司。2.1.3 实验仪器培养皿，锥形瓶，5ml、10ml离心管，30、37培养箱，恒温水浴锅（精度为0.1），分析天平，酸度计（精确至0.01），离心机（3000 r/min），无菌操作台，紫外分光光度计，移液器（精确度为1L），高压灭菌锅。2.1.4 实验的时间和地点本实验从开始活化菌种到最终纤维素酶活测定历时共计四十多天，其中培养基的配制，细菌生长量的测定及纤维素酶活的测定是在动物营养实验室；乳酸菌培养基的高压灭菌，接种及培养是在动物预防兽医实验室。2.2 实验方法2.2.1 乳酸菌的活化将冷冻保存的纤维素酶基因重组乳酸菌菌种放置无菌操作箱中至室温，用接种环将其接种在有MRS固态培养基的培养皿中（MRS培养基、培养皿均已高压灭菌），接种时将接种环轻烧灭菌、冷却后，蘸取纤维素酶基因重组乳酸菌菌液少许，在培养皿上划线（划线时不要划破琼脂，不要划的太疏，不要过多划线，以免出现菌苔），划毕，将培养基用皿盖盖好，在37条件下培养24小时，再将培养皿中的单菌落接种在5ml的离心管（5个）中，培养24小时，之后制菌液的玻片并镜检14，合格后冰箱4保存备用。2.2.2 实验的设计本实验采用逐步确定单一变量和正交实验相结合的设计12,30来确定纤维素酶基因重组乳酸菌的最佳生长条件和最佳产纤维素酶的条件。（1）确定单一变量的设计：乳酸菌的基础培养基23,24为：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。（pH 6.4）。盐液甲由MgSO47H2O 11.5g，MnSO44H2O 2.8g融入100ml蒸馏水制成。以如上乳酸菌基础培养基为基础，每水平下设3个重复，逐步确定单一变量对实验结果的影响。、对培养时间确定的培养基为：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml.（pH 6.4），将培养时间设置为18h，22h，24h，26h，30h。、对乳酸菌酸度确定的培养基28为：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml，将培养基的酸度调为3.0，4.0，5.0，6.4。培养时间已经由上测得。、对乳酸菌培养温度确定的培养基为：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。培养的时间，培养基的酸度已由上测得。、对碳源的确定培养基26配制如下：培养基一：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。培养基二：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；蔗糖 20g；蒸馏水 100ml。培养基三：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；麦芽糖 20g；蒸馏水 100ml。培养的时间，温度，及培养基的酸度已由上测得，按测得结果培养。、对氮源的确定培养基26配制如下：培养基一：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼柠檬酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。培养基二：氯化铵 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼柠檬酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。培养基三：水解乳蛋白 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼柠檬酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。培养的时间，温度，培养基的碳源，pH已由上测得，按测得结果培养。、对磷酸盐浓度的确定培养基27配制如下：培养基一：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼柠檬酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 1.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。培养基二：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼柠檬酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。培养基三：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼柠檬酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾3.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。培养的时间，温度，培养基的碳源，氮源，pH已由上测得，按测得结果培养。、对乳酸菌需氧条件的确定培养基配制为：胰蛋白胨 10g；牛肉浸膏 10.0g；酵母浸出物 5.0g；吐温 80 1.0ml；盐液甲 5.0ml；枸橼柠檬酸二铵 2.0g；三水醋酸钠 5.0g；磷酸二氢钾 2.0g；葡萄糖 20g；蒸馏水 100ml。根据已测得的最佳培养基成分替换基础培养基中的相应成分，分别在无氧，充足氧，适量氧的条件下对乳酸菌进行培养。（2）正交试验设计正交试验设计中选定对纤维素酶基因重组乳酸菌生长状况和产纤维素酶状况的具有影响的碳源、氮源、磷酸盐浓度，氧气状况，pH值、温度、培养时间等7个因素，每个因素下面选定有代表性的3个水平进行设计，选择L18（37）的正交表。 表1 L18（37）正交表正交设计组碳源氮源磷酸盐浓度氧气pH温度培养时间1葡萄糖胰蛋白胨1无氧6.43018h2葡萄糖氯化铵2适量5.03724h3葡萄糖水解乳蛋白3充足3.04230h4蔗糖胰蛋白胨1适量5.04230h5蔗糖氯化铵2充足3.03018h6蔗糖水解乳蛋白3无氧6.43724h7麦芽糖胰蛋白胨2无氧3.03730h8麦芽糖氯化铵3适量6.44218h9麦芽糖水解乳蛋白1充足5.03024h10葡糖糖胰蛋白胨3充足5.03718h11葡萄糖氯化铵1无氧3.04224h12葡萄糖水解乳蛋白2适量6.43030h13蔗糖胰蛋白胨2充足6.44224h14蔗糖氯化铵3无氧5.03030h15蔗糖水解乳蛋白1适量3.03718h16麦芽糖胰蛋白胨3适量3.03024h17麦芽糖氯化铵1充足6.43730h18麦芽糖水解乳蛋白2无氧5.04218h 将按照实验设计进行培养的样品，每一组做四个平行，其中两个样品用于测乳酸菌的生长量OD600值，两个样品经离心后用DNS法测其纤维素酶酶活力活。2.2.3 菌液的OD600值的测定OD600 指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。通过吸光值的定义可以知道，吸光值于溶液中的吸光物质的浓度成正比。它的一个重要应用，就是利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况,所以通常用来指菌体细胞密度。本试验通过测定纤维素酶基因重组乳酸菌的OD600值来确定乳酸菌的生长情况。测定时以相应的培养基为空白对照，在紫外分光光度计上正规操作。2.2.4 纤维素酶酶活的测定 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖13。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶降解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光光度法测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。纤维素酶酶活的定义为，在37，pH 5.5 的条件下，每分钟从4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U）。2.2.4.1 主要试剂的配制乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH 5.5）：称取乙酸钠（CH3COONa3H2O）23.14g,加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH偏离5.5,再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5。葡萄糖溶液（10.0mg/ml）：称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。羧甲基纤维素钠溶液（8g/l）:称取羧甲基纤维素钠（Sigma G5678）0.8g，加入80ml乙酸-乙酸钠缓冲液。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠溶解。（注意：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是液体的总体积不能超过100ml）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至100ml。羧甲基纤维素钠能立即使用，用前摇匀。4条件下避光保存，有效期为3d。冷冻保存，有效期为2个月（使用前在4条件下解冻）。3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色液：准确称取6.3g 3,5-二硝基水杨酸，NaOH 20g溶于适量的蒸馏水中，然后称量182.0g酒石酸钾钠溶于300-500mL蒸馏水中，加热至充分溶解，将上述两溶液混合，再加5.0g重蒸酚和5.0g亚硫酸钠，搅拌溶解，定容至1000mL，贮于棕色瓶中置冰箱一周后使用，用前过滤。2.2.4.2 标准曲线的绘制13 吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，并用水定容至25ml，制成标准空白样。 分别吸取葡萄糖溶液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00和7.00ml，分别用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至100ml，配制成质量浓度为0.100.70mg/ml的标准溶液。 分别吸取上述质量浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（做两个平行），分别加入到刻度试管中，在分别加入2 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液和DNS试剂5ml。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却至室温，并用水定容至25ml。以标准空白为对照调零，在波长540nm处测定吸光度值。 以葡萄糖的质量浓度为Y轴，吸光度值为X轴，绘制标准曲线。2.2.4.3 测定步骤 吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液，37平衡10min。 吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37平衡10min。 吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入5ml DNS试剂，电磁振荡3s。让后加入羧甲基纤维素钠溶液2.0ml，37保温30min，沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在波长540nm处测定吸光度A0。 吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml羧甲基纤维素钠缓冲液（已经过37平衡），电磁振荡3s， 37精确保温30min。加入DNS试剂5ml，电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在波长540nm处测定吸光度A。 2.2.3.4 结果计算公式 试样中纤维素酶活力按照下式计算。 X=（A-A0）K + b 1000 /180.2t 式中：X: 样品稀释液的纤维素酶活力，单位为(U/mL)；A为反应液的吸光度；A0为酶空白样的吸光度；K为标准曲线的斜率；b为标准曲线的截距；180.2为葡萄糖的摩尔质量，g/mol；t为酶解反应时间，min；1000为转化因子，1mmol=1000umol。 酶活结果的计算值保留3位有效数字。2.3 数据处理 本试验所有数据均先经Excel软件进行整理后，用SPSS17.0版统计软件中的ANOVA模块进行单因素方差分析。正交试验结果分析及相应的图表均由Excel软件工具制成。3 实验结果 3.1 葡萄糖标准曲线的绘制根据葡萄糖不同浓度的标准溶液与3,5二硝基水杨酸反应结果，测得的相应的吸光度如表2所示。根据测定结果，用Excel制作直线图(图1)得到标准曲线方程为Y=1.3654 X+0.0889，标准曲线散点图相关性系数R=0.9996，线性良好。表2 葡萄糖浓度与吸光度葡萄糖浓度（mg/ml）吸光度Abs5400.10.0080.20.0810.30.1550.40.2280.50.3010.60.3740.70.448由标准曲线方程和2.2.3.4中纤维素酶活力计算公式得纤维素酶活力计算公式为：X=（A-A0）1.3654+ 0.0889 1000 /180.2t由此公式确定下列分组的酶活（式中反应的时间t为2min）。3.2 单因素确定的结果3.2.1 对培养时间的确定的数据结果(酶活力单位均为U/ml，下表同) 表3 培养时间与测定数据培养时间OD600酶活力18h0.5010.104b0.0910.051b24h0.7230.099b0.1760.033b26h1.0020.048a0.2510.023a30h1.0100.049b0.2530.025b注：同列上标字母相同为差异不显著(P0.05)；上表不同为差异显著(P0.05)。下列各表同。 由表3可知，培养时间达到26h时，所测得菌液浓度OD600值及酶活力虽相对于30h的培养时间差异不显著，但和18h和24h的测定结果相比均差异性显著(P0.05)，由图2、3所示，随时间的增加，乳酸菌的菌液浓度和纤维素酶活力逐渐加，但当培养的时间达到26h时，生长量达到最佳状态，酶的活力也基本上达到最大，之后乳酸菌处于衰退期，酶的活性也相应的不再增加。所以可以确定26h为纤维素酶基因重组乳酸菌的最佳培养时间。3.2.2 对培养基酸度确定的数据结果表4 培养基酸度与测定数据pHOD600酶活力2.00.4570.251b0.0680.015b3.01.0090.039a0.2570.033a4.00.8580.045b0.1870.036b5.00.7460.089b0.0960.055b6.40.6330.039b0.0740.034b由表4可知，pH值为3.0时所测得菌液浓度OD600值及酶活力均相对于其他pH值是测得的数据差异性显著(P0.05)。由图4、5所示，随培养基pH的增加，乳酸菌的菌液浓度和纤维素酶的活力也相应的增加，但当pH达到5.0时，乳酸菌的生长量及纤维素酶活力均达到最大，pH达到6.4时，乳酸菌的生长量及纤维素酶活力均相应下降。所以可以确定pH值3.0为纤维素酶基因重组乳酸菌的最佳培养基酸度。3.2.3 对培养温度确定的数据结果表5 培养温度与测定数据温度OD600酶活力300.5720.251b0.0820.061b340.8240.103b0.1580.021b371.0580.113a0.2180.031a390.4310.211b0.0730.059b420.1350.201b0.0280.019b由表5可知，37培养条件下所测得菌液浓度OD600值及酶活力均相对于其他温度条件下测得的数据差异性显著(P0.05)。由图6、7所示，在实验所设置的的时间梯度中，在一定的范围内随温度的增加，纤维素酶基因重组乳酸菌的生长状况及产纤维素酶量的状况也随之增加，在37时达到最大，超过这个温度，它们便急剧下降。所以可以确定37为纤维素酶基因重组乳酸菌的最佳培养温度。3.2.4 对需氧状况确定的数据结果表6 氧气状况与测定数据氧气状况OD600酶活力无氧1.0760.033a0.2540.033a适量氧0.4710.073b0.0860.045b充足氧0.2760.099b0.0340.026b由表6可知，无氧条件下所测得的菌液浓度OD600值及酶活力均相对于其他氧气状况下测得的数据差异性显著(P0.05)。由图8、9所示，在实验设置的三个不同的氧气状况中，无氧的培养条