毕业论文--一株黑蛋巢真菌的培养及其代谢产物研究.docx

中文摘要粪生黑蛋巢菌（Cyathus stercoreus (Schw.)de Toni）是四川黑蛋巢菌（Gyromitra xinjiangensis Cao, Fan et Liu sp. nov.）的一个分支，属于黑蛋巢菌属真菌（Cyathus）。以前的报道大多针对黑蛋巢菌属别的种真菌，而本文研究的这种粪生黑蛋巢菌次生代谢产物的相关研究报道较少，因此有很大的研究空间。本实验以这种粪生黑蛋巢菌为实验材料，对其进行固体发酵培养，提取得到丙酮粗提物，根据TLC薄层色谱跟踪分析，通过硅胶，凝胶，和反相柱层析等色谱分离方法，分离特异性化合物。通过质谱，1H-NMR、13C-NMR、DEPT等核磁共振这些波谱手段，对分离纯化得到的单体化合物，进行结构鉴定。最后我们从这种粪生黑蛋巢菌的丙酮粗提物中分离到2种化合物，通过波谱研究技术并参考相关文献和数据库，鉴定这两种化合物分别是：麦角甾醇和 2-non-1-enyl-1H-quinolin-4-one，这两种已知化合物在这种粪生黑蛋巢菌中是首次被分离得到。关键词：粪生黑蛋巢真菌，代谢产物，培养提取，色谱分离，波谱鉴定ABSTRACTCyathus stercoreus (Schw.) De Toni is a branch of Gyromitra xinjiangensis Cao, Fan et Liu sp. Nov which belonging to the genus Cyathus. It looks like a black bird with black eggs nest ,and is widely distributed in our country. In this experiment, the fermented Cyathus was used as the experimental material, and the crude acetone extract from solid fermentation media was harvested for further isolation. Combined with TLC thin layer chromatography，the specific compounds can be traced and separated by the means of chromatographic methods such as silica gel column, reversed-phase Rp-C18 column and SephadexLH-20. The pure compounds were elucidated by means of spectroscopic techniques including mass spectrometry as well as nuclear magnetic resonance（1H-NMR、13C-NMR、DEPT）. Finally, we isolated two compounds from the crude acetone extract of the Cyathus. The compounds were identified by spectroscopy and the related literature and database. The two compounds were: ergosterol and 2-non-1 -enyl-1H-quinolin-4-one, and it is the first time that these two compounds have been isolated from this Cyathus.Key words: Cyathus, secondary metabolite, extraction and separation, structure identification目录前 言1第一节 黑蛋巢菌及其次生代谢产物的研究现状1第二节 论文研究背景6第三节 论文研究思路与方法6第一章 一株黑蛋巢真菌的培养发酵9第一节 相关材料9第二节 实验方法9第三节 实验结果10第二章 黑蛋巢真菌发酵产物的提取11第一节 相关材料11第二节 实验方法11第三节 结果分析12第三章 黑蛋巢真菌丙酮粗提物的分离纯化13第一节 相关材料13第二节 实验方法13第三节 结果分析17第四章 分离化合物的结构鉴定结果18第一节 化合物D-1结构鉴定结果18第二节 化合物D-2结构鉴定结果19第五章 结果与讨论21第一节 实验结果21第二节 讨论21致谢23参考文献24前 言第一节 黑蛋巢菌及其次生代谢产物的研究现状1.1黑蛋巢菌的研究现状。真菌是菌物中类别最多的一类，也是形态差异最大的一类。根据统计，世界上可能有15000种真菌，可供食用的约2000种，这之中有药用价值的约 650种 (Rai M et al. 2005)。而其种类的多样性，决定了其代谢产物的多样性，而化合物的多样性决定了其生物活性多样性。目前已经有多种具有生物活性的化合物例如生物碱，萜类，甾醇，多糖等从真菌中被发现，它们具有抗炎，抗肿瘤，抗衰老等生理功效(高锦明 2003；Gao 2006; Liu 2005; Liu 2006)。除了医药活性，许多真菌代谢产物还具有农用生物活性(王大浩等 2005)。此外，真菌中研究发现的化合物具有两个优势特点，第一个就是结构骨架新颖，能表现重要活性，容易成为合成许多重要物质的先导化合物，换句话说就是真菌生物合成的“创新指数”很高。第二个是由于真菌自身易繁殖，所以它不仅可以作为材料研究代谢产物，也可以作为材料大量发酵生产优势产物。真菌的这两个特点对化学和药物学科的进步以及维护人类健康方面都有重要的意义。虽然目前人们对真菌及其代谢产物研究十分重视，但是我国真菌90%以上种类还没有被鉴别 (Hawksworth 2001; Kirk et al. 2001)，对其代谢产物的研究也不到1%，所以真菌具有非常广阔的研究空间与价值(Kawagishi H et al. 2007)。黑蛋巢菌是鸟巢菌科的真菌，形似鸟巢，种类繁多，其中不少都有药用价值。近年来人们对黑蛋巢菌的形态学分类及其代谢产物的研究一直都有新的发现。1987年，刘波等报道了内蒙黑蛋巢菌,盘柄黑蛋巢菌,太原黑蛋巢菌,毛被黑蛋巢菌四个新种和天山黑蛋巢毛被变种,环状黑蛋巢武夷山变种二个新变种。2003年，李榆梅等报道了黑蛋巢菌属Cyathus一个中国新纪录种.此种为浅棱黑蛋巢菌C.costatus Lloyd ex Brodie,其模式标本产地为美国,新纪录种标本存在山西大学真菌标本室。 1.2黑蛋巢菌次生代谢产物国内外研究现状1.2.1鸟巢烷型二萜1954年，有研究者发现从隆纹黑蛋巢的菌丝体具有抑制细菌生长的作用。上个世纪60年代，在亚伯达的洛矶山脉加拿大科学家Brodie发现了一株新的鸟巢真菌并成功培养，并从鸟巢菌(Cyathus helenae Brodie)的海伦布罗迪液体培养中发现这种真菌有明显的抗菌活性 (Allbutt et al. 1971)称为鸟巢菌素(Cyathin)。此后Ayer 等人从中分离出活性次生代谢产物，进而发现有一个5/6/7三环系核心碳骨架新颖结构的鸟巢烷型二萜cyathins。首次，分离出了蛋巢菌素cyathin A3(1)和 allocyathin B3(2) (Ayer W et al. 1973)。后来在同种真菌中分离并通过出另外5种新型鸟巢烷型二萜代谢产物蛋巢菌素 B3 (3)、蛋巢菌素C3 (4)、neoallocyathin A4 (5)、蛋巢菌素 A4 (6) 和蛋巢菌素 C5 (7)。上个世纪70年代，Ayer等从非洲黑蛋巢 (Cyathus africanus) 中分离到4 个新鸟巢烷型二萜类次生代谢产物(Johri B.N et al. 1973)，分别是: cyafrin A4(8)，cyafrin B4(9)，allocyafrin B4(10)和 cyafrin A5(11)。以及 2 个已知二萜化合物：蛋巢菌素 A3 (1)和蛋巢菌素 B3 (2) (Ayer et al. 1978)。此后，在一种生长在热带或者亚热带地区生长的鸟巢菌(Cyathus earlei) 子实体中分离出6 个新的鸟巢烷型二萜类代谢产物：cyathatriol(12)、11-O-acetylcyathatriol(13)、15-O-acetylcyathatriol(14)、O-diacetylcyathatriol(15)、cyathin B2(16) 和 allocyathin B2(17) (Ayer W.A et al. 1979)。六种新二萜都对金黄色葡萄球菌有中等的抗菌活性，其中17的已由布鲁斯特的苯甲酸规则(Brewster J.H et al. 1961)确定绝对构型。2013年以来，Han J等从Cyathus africanus 的固体培养分离鉴定出五个新的鸟巢烷型二萜类代谢产物：cyathins D-H(18-22)(Han J et al. 2013)，还有三个已知的二萜：neosarcodonin O，cyathatriol和 11-O-acetylcyathatriol。此后，Xu Z等从Cyathus hookeri Berk (CGMCC 5.1116) 的液体培养基中分离得到( Xu Z et al. 2013)蛋巢菌素I（23），猴头菌素 I，并且发现它们具有抗炎活性。2014 年，Wang B等从Cyathus gansuensis(CGMCC 5.1117)的固体培养中又发现了七个鸟巢烷型二萜二萜类代谢产物，cyathins J-P(24-30)，以及分离两已知同系物。(Wang B et al. 2014)2015年，Bai R等（Bai R et al. 2015）从隆纹黑蛋巢菌的发酵液中分离并鉴定了 6 个鸟巢烷型二萜木糖苷：striatoids A-F(31-36)。其中，化合物 32 和 33 结构中的 C-15 与 C-4之间有特殊的环氧桥结构，这是该类型鸟巢烷型二萜类化合物的首次报道。以 PC12 细胞（来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤）为模型，6个化合物经过神经营养活性的测试，显示具有不同程度的NGF依赖的促神经突起生长活性。2016年，Richter等在泰国北部发现一株隆纹黑蛋巢菌中分离鉴定出两种嘧啶鸟巢烷型二萜 pyristriatins A 和 B (37 和 38)，以及已知化合物striatin C，其中pyristriatins A 和 B具有有抗生素活性，能抗细菌和真菌，并且这种有嘧啶环的鸟巢烷型二萜是首次报道。（Christian Richter et al.2016）1.2.2鸟巢烷型二萜糖苷类从黑蛋巢菌中分离出的化合物Striatals、striatins 和 erinacines 都称为 cyathane-木糖苷，它们是含有戊糖(D-木糖)基团的鸟巢烷型二萜化合物。这类化合物大多数主要来自黑蛋巢菌属和猴头菇。 1977 年，Anke等从担子菌隆纹黑蛋巢菌 (Cyathus striatus No. 12) 的菌丝体中分离得到了3个新的二萜：striatin A (39)、B (40) 和C (41)。striatin A 的结构已被单晶x 射线衍射实验确定，它是一个含有戊糖残基的鸟巢烷型二萜类化合物。这些化合物对半知菌类和许多革兰氏阳性菌，也包括一些革兰氏阴性菌都有很好的活性，可以作为具有抗菌和抗真菌特性的新型抗生素，化合物 39 和41 还能抑制蛋白质和 RNA 的合成 (Anke et al. 1977; Hecht et al. 1978)。1988年，又从Cyathus striatus (Huds. ex Pers.) Willd (Steglich W et al. 1981)和C. species (Anke T et al. 1988)中分离出 3 个新型二萜类抗生素：striatals A-C (42-44)。striatal D (45)是从Gerronema fibula (Bull. ex Fr.)的发酵液中分离出来的 (Anke T et al. 2002)。1.2.3其他类型化合物2007年，Hahk-Soo Kang等从黑蛋巢菌发酵液中分离出三种抗氧化的聚酮化合物，cyathusals A (1), B (2), and C (3), 还有已经发现的化合物 pulvinatal (4)。三种化合物已通过氮谱确定结构，且都具有清除自由基的活性（Hahk-Soo Kang et al. 2007）。2015，白瑞等（Bai R et al. 2015）从隆纹黑蛋巢菌的发酵液中分离并鉴定了四个已知化合物(7-10)结构类型涉及环二肽和苯环衍生物类，分别为 Cyclo-(S-Pro-R-Leu)，2-Hydroxymethyl-phenol，(2R,3S)-pterosin C，(2S,3S)-pterosin C。第二节 论文研究背景真菌中研究发现的化合物具有两个优势特点，第一个是结构骨架新颖，能表现重要活性，容易成为合成许多重要物质的先导化合物，换句话说就是真菌生物合成的“创新指数”很高。第二个是由于真菌自身由于易繁殖，不仅可以作为材料研究代谢产物，也可以作为材料大量发酵生产优势产物。真菌的这两个特点对化学和药物学科的进步以及维护人类健康方面都有重要的意义。本文研究的粪生黑蛋巢菌（Cyathus stercoreus (Schw.)de Toni）属于鸟巢菌家族黑蛋巢属，一般在粪上或垃圾堆上群生，分布于我国河北、山西、内蒙古、黑龙江等地区，可以药用，具有极高的研究价值。以前的报道大多针对黑蛋巢属别的种真菌，而对本文研究的这种粪生黑蛋巢菌的代谢产物研究报道较少。因此，本文对这种粪生黑蛋巢菌的代谢产物化学成分进行系统性的研究，希望可以分离出这种粪生黑蛋巢真菌自身独特的重要化合物，在一定程度上补充对这种粪生黑蛋巢菌的研究。第三节 论文研究思路与方法3.1研究思路3.1.1黑蛋巢菌的发酵培养及提取本实验采用固体发酵法，用燕麦西红柿培养基培养黑蛋巢菌，将发酵产物烘干，粉碎，再用适当溶剂进行提取。最后旋蒸提取液，获得膏状粗提物。3.1.2黑蛋巢菌代谢产物化学成分的分离利用TLC薄层色谱跟踪分离预测，综合硅胶柱层析、凝胶柱层析和反相柱层析等各种色谱分离方法，分离特异性化合物，再通过质谱和核磁共振等波谱技术对分离纯化得到的单体化合物进行结构鉴定。技术路线：如图技术路线黑蛋巢菌发酵培养成分提取（溶剂法）分离纯化（色谱技术）结构鉴定（波谱技术） 以下对本实验中使用的主要研究方法与手段进行简要介绍。3.2研究方法3.2.1 现代分离纯化方法色谱技术色谱法又称层析法,是利用样品中各成分理化性质如分子极性、大小、吸附性能、分配性能等有差异，所以以不同含量(浓度)分布于流动相和固定相之中，在流动相推动下沿着固定相以不同的速度运动，从而得以分离的方法。本文所用色谱法按分离机理分类可分为吸附色谱，分配色谱，空间排阻色谱1.吸附色谱硅胶柱层析，薄层层析色谱（TLC）根据组分对活性固体表面吸附力的不同，通过洗脱剂洗脱(展开剂展开）实现分离。其中硅胶柱色谱多用于量多组分初分离，薄层层析色谱即点板贯穿于整个提取和分离纯化过程的每一步，用于组分成分预试，洗脱剂选择，分离效果以及纯度检验。2.分配色谱十八烷基键合硅胶色谱柱，二醇基键合硅胶色谱柱 根据不同溶质分子在固定相和流动相中不同的分配系数进行分离。大多分离问题都可用键合相色谱解决。3.空间排阻色谱-羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）凝胶色谱柱的作用是利用分子筛将组分按物质分子量大小进行分离。3.2.2 结构鉴定主要手段波谱技术结构研究的主要程序：a.初步推断化合物类型（TLC)；b.质谱测定分子组成与分子式，计算不饱和度；c.通过分子式结合推断可能的化合物类型，数据库检索，与同分子式的标品对照（TLC,熔点)，如果没有标品，那么作一维核磁（氢谱和碳谱），紫外，红外，数据与文献报导或已知数据库比较，如果对不上，新化合物。d.二维核磁，确定结构。本文使用波谱方法主要有质谱法，红外光谱，紫外光谱，核磁共振波谱1.质谱法提供分子碎片，尤其是分子离子峰。可以给出化合物的精确分子量，并可求算分子式。2.红外光谱在红外区域里，分子中价键的伸缩及弯曲振动会引起的吸收，不同分子的吸收图谱也不同，根据官能团的不同，特异分子会有特异的吸收区，这类特异区域我们称之为频率区或指纹区，因此红外光谱多用于鉴别官能团特征。3.紫外-可见吸收光谱分子中共轭双键的增加，或者说分子整体共轭体系增加，都会使其的光吸收偏向紫外甚至是可见光区域，因此紫外-可见吸收光谱一般用于检测分子中的共轭双键、发色团及具有共轭体系的助色团。4.核磁共振波谱1HNMR， 13C-NMR，DEPT等多种核磁共振技术，可以通过提供分子中各原子的类型、数目、互相连接方式、周围化学环境，从而能推断出该分子构型、构象等结构信息，推测其结构式。第一章 一株黑蛋巢真菌的培养发酵第一节 相关材料1.1供试菌种从白城盐碱地获得的黑蛋巢菌株，经过秦建春副教授鉴定，确定其为粪生黑蛋巢真菌，后由实验室研究生进一步筛选并保存于吉林大学植物科学学院天然产物化学实验室。 1.2 培养基西红柿燕麦培养基：燕麦片 30g，西红柿汁15ml，琼脂 20g，蒸馏水 1L（燕麦片煮 20-30 分钟，纱布过滤，取滤液，加西红柿榨汁取15ml、琼脂糖，补水到 1L）。高温灭菌0.1Mpa ，113，25分钟。1.3 实验仪器高压蒸汽灭菌锅：日本三洋（SANYO）生物安全柜：苏州净化设备有限公司恒温培养箱：金坛市薛埠鑫栋实验仪器厂第二节 实验方法2.1 菌种活化与扩培2.1.1燕麦西红柿培养基的配制：称量30g燕麦片，加水煮20分钟，用纱布过滤，取滤液，加入鲜榨西红柿汁15ml，混合均匀后，在60状态下加入20g琼脂糖，搅拌均匀。每个1L锥形瓶中配制500mL培养基，共配制6瓶。培养基配制完毕，高温灭菌0.1Mpa ，113，25分钟。2.1.2 菌种活化实验使用的黑蛋巢菌种，原先是冷藏保存在-81冰箱里，在进一步发酵实验前，需要先将菌种从冰箱里取出来，在常温下放置一段时间，使之不再处于休眠，而进入生长周期。2.1.3 菌种扩培在生物安全柜的无菌环境中，先用酒精灯灼烧接种针，挑取一点试管中黑蛋巢菌丝，在燕麦西红柿培养基上接种，共接种三个培养皿，并用封口膜将它们都封好。然后把三个培养皿放到28恒温培养箱中，每各两天观察一次菌种生长状况，一周后菌株长势良好，可以进行下一步的发酵。2.2 菌种发酵1.生物安全柜事先用紫外灯消毒30min，从扩培平板上挑取长势较好的黑蛋巢菌菌饼，用接种针接种在事先配制的装有西红柿燕麦固体培养基的锥型瓶中，培养瓶打开前后用酒精灯灼烧瓶口，接种完成后，用封口膜将瓶口封好。2.将接种了黑蛋巢菌的培养瓶置于28培养箱中静置培养，第一周每两天查看一次，排查发酵过程中的污染情况，如果发现有严重杂菌污染，则取出被污染的培养基,需要取出来重新配制再接种。后期每周查看一次发酵情况。3.两个月后，固体培养基基本被消耗殆尽，大部分黑蛋巢菌株长势良好，停止发酵，用玻璃棒勾出培养物。4.将获得的培养物集中到较大的容器，密封保存。第三节 实验结果发酵完成，获得大量黑蛋巢菌培养物，其中可能含有多种代谢产物。第二章 黑蛋巢真菌发酵产物的提取第一节 相关材料1.1实验材料黑蛋巢菌发酵产物丙酮（北京化工厂），二氯甲烷（北京化工厂），甲醇（北京化工厂）1%香草醛硫酸乙醇显色剂（称1g香草醛，溶于100ml的10%硫酸乙醇中）TLC层析硅胶薄板（GF254浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）1.2 实验仪器旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司循环水式多用真空泵：上海博讯实业有限公司医疗设备厂万能粉碎机：上海申生科技有限公司真空干燥箱DZF-6050 型：河南巩义市英峪予华仪器厂移液枪2X62815 型（100-1000ul）：赛默飞世尔上海仪器有限公司数控超声波清洗器：昆山市仪器有限公司第二节 实验方法2.1发酵产物的烘干粉碎发酵结束以后，用干净的玻璃棒勾出固体培养基中的黑蛋巢菌培养物。由于培养物含有水分无法粉碎，所以先把培养物集中在白瓷盘上，放进50的恒温干燥箱内，加速其水分蒸干。一周后，再将干燥的固体培养物放入万能粉碎机进行粉碎，从而得到培养物粉末。收集粉末 ，等待溶剂法提取。2.2发酵产物的丙酮提取 将粉碎好的培养物粉末用漏斗装进一个2L的大锥形瓶中，每次加2L丙酮浸泡，共浸泡3次，每次浸泡24h，并利用超声振荡充分提取黑蛋巢菌培养物粉末中的化学成分。将三次获得的提取溶液进行抽滤，得粗提取液。剩余残渣置于丙酮中二次充分侵泡，重复上述实验过程10次，再将所得所有丙酮提取液合并。2.3发酵产物的旋蒸浓缩 将获得的大量丙酮提取液收集于旋蒸瓶中，打开旋转蒸发仪对样品进行旋转浓缩，期间样品液面不得高于外部蒸馏水面。将提取溶剂丙酮完全蒸出后，可见残余的膏状样品全部依附于旋蒸瓶壁上。回收丙酮试剂，将膏状提取物用少量丙酮溶解，置于小瓶中，密封保存，以便后续分离。第三节 结果分析通过上述提取步骤，获得了大量膏状黑蛋巢真菌丙酮粗提物。再用TLC薄层色谱对粗提物进行分析，（展开剂为二氯甲烷：甲醇=15：1）分析结果如图。第三章 黑蛋巢真菌丙酮粗提物的分离纯化第一节 相关材料1.1实验试剂二氯甲烷（北京化工厂），甲醇（北京化工厂），乙酸（北京化工厂）1%香草醛硫酸乙醇显色剂（称1g香草醛，溶于100ml的10%硫酸乙醇中）1.2 层析柱填料柱层析硅胶(80-120目、200-300 及300-400 目)：青岛市海洋化工厂TLC薄层层析硅胶：青岛海洋化工厂羟丙基葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20：德国默克公司RP-C18 反向硅胶：德国默克公司1.3 实验仪器 旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司通风厨：北京成威实验室装备工程技术有限公司可调式电热板：河南巩义市英峪予华仪器厂循环水式多用真空泵：北京市永光明医疗仪器有限公司三用紫外线分析仪ZF-6 型：上海嘉鹏科技有限公司飞科电吹风：上海飞科电器股份有限公司移液枪2X62815 型（100-1000 ul）：赛默飞世尔上海仪器有限公司第二节 实验方法2.1硅胶柱层析色谱操作步骤：（1）拌样和装柱：首先用尽量少的丙酮试剂，将浓缩物溶解稀释到适当浓度（滴在硅胶颗粒上快速内渗）。然后称量，约为样品重量三倍的，柱层析硅胶（80-120目颗粒度），置于研钵内，再用胶头滴管，均匀地将样品，滴加到研钵中的硅胶颗粒上，并用勺子，不停搅拌硅胶，使样品尽量均匀地依附在硅胶颗粒表面，待溶剂基本挥发完全后，硅胶呈细小沙粒状，过程中避免出现由于粗提物样品太多，搅拌不均匀，硅胶黏集成块的状况（可视情况添加硅胶或者用玻璃棒碾压），最后将搅拌完毕的样品与硅胶晾凉。装柱时将200-300目分离用硅胶和样品装入玻璃柱中，上层再加入保护层硅胶和棉花，三层硅胶体积比为5：1：1，每加一层硅胶，都要用薄膜真空泵将硅胶抽实。装柱完成，准备后续洗脱。（2）洗脱：首先实验前，应该对粗提物，进行TLC硅胶薄层色谱分析，根据样品化合物组分，是否在TLC硅胶薄层色谱板上，能够很好的相互分离开，选择合适的洗脱剂系统，该系统一般由一个极性较大的，和一个极性较小的溶剂组成，通过两种溶剂的不同比例混合，调节洗脱时的极性。洗脱过程中，可以根据TLC薄层色谱分析中的展开效果，或者辅以手提紫外灯下肉眼观察，适时提高混合溶剂极性，依次洗脱下从小到大不同极性的化合物。（3）收集：用干净的三角瓶依次接样，旋蒸洗脱组分，将所得浓缩物用适宜溶剂溶解，通过TLC薄层色谱查看分离效果并寻找适于分离的化合物。最后将含有此化合物的样品合在一起，等待下一步分离。2.2 Sephadex LH-20柱层析色谱操作步骤：（1）上样和洗脱：用胶头滴管将溶解的样品沿玻璃柱壁缓慢加在填料顶端，避免因加样过急造成填料顶端表面不平整，影响分离效果。加样完毕，以同样的手法加入洗脱剂，调节阀门流速，理论上适当调慢流速相当于增加柱长，可以提高分离效果。（2）收集：用干净的三角瓶依次接样，旋蒸洗脱组分，将所得浓缩物用适宜溶剂溶解，通过TLC薄层色谱查看分离效果并寻找适于分离的化合物。最后将含有此化合物的样品合在一起，等待下一步分离。2.3反相（Rp-C18）层析柱色谱操作步骤：（1）上样和洗脱：向完全溶解的样品中，边摇晃边滴加去离子蒸馏水直至有少量样品结晶开始析出，此时再向样品中滴加少量甲醇溶剂，将析出的样品重新溶解，若仍然存在不溶固体颗粒杂质，用塞棉花的漏斗将其滤去。接下来用胶头滴管将溶解的样品沿玻璃柱壁缓慢加在反相填料顶端，避免因加样过急造成填料顶端表面不平整，影响分离效果。加样完毕，打开反相柱底端阀门并辅以吹气泵加压提高样品流速，待样品全部没入填料中后，沿玻璃柱壁缓慢加入适当比例的甲醇和水混合溶剂进行洗脱。（2）收集：用干净的三角瓶依次接样，旋蒸洗脱组分，将所得浓缩物用适宜溶剂溶解，通过TLC薄层色谱查看分离效果并寻找目标化合物。最后将含有此化合物的样品合在一起，等待下一步分离。 2.4 TLC硅胶薄层色谱操作步骤：（1）点样：将样品用适量溶剂溶解后，事先用铅笔在薄层板距底边1.5cm处轻轻画好点样基线。用毛细管蘸取样品并点于薄层板上，点样一般为圆点，分多次点样，每次点完待溶剂风干后再点下一次，避免点样斑点过大以至于相邻斑点相互影响，点样直径不超过5mm，点样距离一般为1-1.5cm即可。为防止边缘效应，可将薄层板两边刮去1-2cm，再进行点样。（2）展开：首先选择合适的展开剂以及比例，最好使目标化合物与前后化合物有一定分辨性。然后配制展开剂倒入展开室，再将点好样品的薄层板用长镊子放入展开室的展开剂中，展开剂不要没过点样处，展开到适宜高度，用长镊子取出薄层板，晾干，等待显色处理。（3）斑点检出：将展开后的薄层板先用紫外光灯显色。均匀喷洒10%硫酸乙醇显色剂后加热薄层板，检出无色组分。 2.5具体分离流程图： 凝胶柱层析 甲醇洗脱 小硅胶柱层析 二氯甲烷：甲醇（50：1）反相柱层析 甲醇：水（3：10，2：5，1：2，3：5，7：10，4：5，9：10，1:1） 凝胶柱层析 甲醇洗脱 凝胶柱层析 二氯甲烷：甲醇（6：4） 硅胶柱层析 二氯甲烷：甲醇 （80：1，40：1，20：1，10：1,5：1，2：1）O-2-1O-2-2丙酮粗提物O-1O-2O-4O-5O-3ABEDC化合物1C-1C-2C-3C-4C-5C-6C-7C-8C-9化合物2化合物3化合物4 第三节 结果分析1.经过对提取物的初步分离纯化，获得了化合物-1，化合物-2,化合物-3,化合物-4四种化合物，分别编号为D-1,D-2,D-3,D-4： D-1为白色粉末，TLC薄层色谱在254nm与365nm紫外灯下不显色，烤板显棕色； D-2为淡黄色粉末，TLC薄层色谱在254nm与365nm紫外灯下显蓝色，烤板显黄色； D-3为白色粉末，TLC薄层色谱在254nm与365nm紫外灯下不显色，烤板显红色； D-4为白色粉末，TLC薄层色谱在254nm与365nm紫外灯下不显色，烤板显绿色。2.在分离纯化的过程中，发现在此株黑蛋巢菌中，有一类紫外下显蓝色而烤板显黄色的化合物十分丰富，并且在后续分离中也多次分离出具有不同极性的这类显色的化合物，虽然还需进一步鉴定，但是可以推测这些化合物在结构上可能有一定相似之处，而此种化合物的丰富存在，或许可作为这种黑蛋巢菌化学成分的某种特征。3.经过对提取物的分离纯化，目前并未在此种粪生黑蛋巢真菌中发现鸟巢烷类化合物，推测在此次实验中这种黑蛋巢真菌中没有产生或者产生极少量鸟巢烷类化合物。第四章 分离化合物的结构鉴定结果 对已获得的纯净化合物中量较大的D-1和D-2进行结构鉴定，得到结构鉴定结果如下：第一节 化合物D-1结构鉴定结果化合物D-1：白色粉末（二氯甲烷）；ESI-MS m/z：377M-H2O；通过数据库检索并与文献（刘玉红等 2005）对照40，发现其碳谱数据与参考文献值一致，可确定化合物X为麦角甾醇（Ergosterol），分子量为396，分子式为：C28H44O 碳谱第二节 化合物D-2结构鉴定结果化合物D-2：黄色粉末（二氯甲烷）；根据与中科院应用化学数据库进行比对，可确定化合物为2-non-1-enyl-1H-quinolin-4-one。氢谱质谱碳谱第五章 结果与讨论第一节 实验结果本实验以一种此前研究较少的黑蛋巢菌种为研究对象，对其进行固体培养，利用多种色谱技术，对其次生代谢产物进行了分离纯化，初步分离出了4个化合物，采用相关波谱技术鉴定了其中两种化合物的结构，并通过与已知文献和数据库对比确定它们分别为麦角甾醇和2-non-1-enyl-1H-quinolin-4-one，这是首次从这种粪生黑蛋巢真菌中分离得到这两种化合物。第二节 讨论2.1麦角甾醇的生产应用研究现状本实验从黑蛋巢菌中分离到了大量的已知化合物麦角甾醇。麦角甾醇由于第一次是从燕麦麦角菌中分离得到而得名，据研究，麦角甾醇是组成微生物细胞膜的必要成分，也可以参与进一步合成维生素D2，因此麦角甾醇在抑制微生物，以及食品方面都能发挥重要作用。但是由于目前合成麦角甾醇方法复杂，成本高，所以微生物发酵大量生产麦角甾醇是目前最常研究的途径，因此对高产菌株的发现和筛选是十分重要的。本文研究的这株粪生黑蛋巢菌中分离到的麦角甾醇量较多，可以想象，如果对其进行筛选，利用不同培养基或者诱导突变，可能就会产生麦角甾醇高产菌株，从而进一步提高麦角甾醇的产量。所以这次的研究十分有意义。2.2 本实验分离结果讨论在分离纯化的过程中，发现在此株黑蛋巢菌中，有一类紫外下显蓝色而烤板显黄色的化合物十分丰富，并且在后续分离中也多次分离出具有不同极性的这类显色的化合物。参考其他同学的菌株研究分离过程，发现在别种黑蛋巢真菌中也有这类显色化合物的存在且极性各不相同。在以后的试验中可以对这类化合物进行不同种黑蛋巢菌间的分离比较。此次实验中并未分离到鸟巢烷类化合物，推测在此次实验中这种黑蛋巢真菌中没有产生或者只产生极少量鸟巢烷类化合物。由黑蛋巢真菌的国内外研究可知，鸟巢烷类化合物在黑蛋巢菌属许多种类真菌中广泛存在。如果假设是此次实验中这种黑蛋巢菌没有产生这类化合物，那么可能是由于这种黑蛋巢菌本身不合成鸟巢烷类化合物，也有可能是本次培养的环境使它不合成鸟巢烷类化合物，这需要后续实验进一步验证。如果假设此次实验中这种黑蛋巢菌产生了极少量鸟巢烷类化合物，而我们无法分离，那么后续实验中我们可以尝试不同发酵方式来从外部调控，或从基因遗传角度从内部调控，使这种黑蛋巢菌的鸟巢烷类化合物产量上调。当然，本实验仅仅是对这种前人研究较少的黑蛋巢菌有了一个初步了解。虽然最后有分离鉴定两种化合物，但是粗提物中还有许多成分，有的由于量少分离出来却无法鉴定，有的在分离过程中就被损失掉了。因此实验还有许多需要注意和改进的地方：菌株发酵环节的设计可能应该更加多样性，提取分离的过程也需要提高分离效率，减少样品损失。对与第一次做天然产物化学方向的实验的我而言，虽然有很多不足，也犯了不少错误，但是这是一次宝贵的学习经验，让我学会并应用了许多天然产物相关理论知识，以及色谱柱等各种实验仪器的使用方法，还有真菌发酵的相关操作。相信对一种新菌株的次生代谢产物的研究是需要多次实验积累的，希望我的实验能成为这积累中有意义的一小步。致谢论文写到这里就结束了，回顾半年多的时间，不论是毕业实验还是反复修改论文，都有太多的感慨和感谢。这不是一个很难很复杂的过程，但它却是一个很重要的成长过程。在这个过程中首先最感谢的是给予我毕业论文指导的秦建春老师，秦老师不仅有丰富的专业知识，对待学生温柔和蔼，上课有趣而又认真。在此，我由衷地感谢他在毕业实验过程中对我们给予的知道和帮助。我还要感谢实验室给予过我许多帮助师兄师姐，感谢他们对我的关爱照顾，困难中伸出的援手。我想没有老师和师兄师姐，我的毕业实验是不会如此顺利而快乐地完成！随着论文答辩的结束，我知道我的大学生活也要画上句号了，时光飞逝，刚入学的场面好像还在眼前。一路走来，有太多的人需要感谢，感谢给我上过课的各位老师，还有四年相伴的小伙伴们，分离不是终点，而是崭新的起点，在以后的日子里，我定不会辜负吉林大学对我的培养，努力成为对社会有用的人！参考文献1 石新卫，两种高等真菌化学成分及生物活性研究，博士毕业论文，2011。2Rui Bai, Cheng-Chen Zhang, Xia Yin, Jing Wei, and Jin-Ming Gao*，Striatoids AF, Cyathane Diterpenoids with Neurotrophic Activity from Cultures of the Fungus Cyathus striatus， American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy，2015。3 陈玉婵等，6 株大型真菌发酵提取物的抑菌及细胞毒活性研究，中国民族民间医药，2009。4 陈颢,李丽娟,万伟超,张继光,涂学飞,李良.旱冬瓜化学成分的研究.云南大学学报( 自然科学版),35( 4):542-548. 2013。5Allbutt, A. 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