微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色ppt课件.ppt

一 实验目的 1 学习并掌握简单染色和革兰氏染色的原理及步骤 2 学习微生物涂片 染色技术和无菌操作 3 巩固显微镜油镜的使用技术 实验二细菌的简单染色法和革兰氏染色法 二 实验原理 1 细菌的简单染色原理 细菌菌体微小而透明 在普通光学显微镜下不易识别 必须通过染色来增加菌体的显示力 从而更清楚地观察到其形态和结构 在碱性 中性或弱酸性溶液中 细菌菌体通常带负电荷 而碱性染料在电离时 其分子的染色部分带正电荷 酸性染料的染色部分带负电荷 因此 碱性染料很容易与菌体结合而是菌体着色 2 细菌革兰氏染色的原理 G 菌和G 菌的细胞壁结构和组成有较大的区别 G 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高 类脂质含量少 经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小 通透性降低 结晶紫 碘复合物被滞留在细胞内 因此细菌仍保留初染时的颜色 经番红复染后呈蓝紫色 G 菌细胞壁的外膜层富含类脂 而且其肽聚糖层次薄 交联度低 乙醇脱色时 细胞壁因类脂被溶解而出现较大缝隙 使得菌体内的结晶紫 碘复合物较易渗出 而使菌体变成无色 再经番红复染就成为红色 三 实验器材 1 菌种 革兰氏染色 培养12h 16h的枯草芽孢杆菌120和培养24h的大肠杆菌 2 染色液和试剂 结晶紫 碘液 95 酒精 沙黄或蕃红3 器材 载玻片 接种杯 木夹子 酒精灯 擦镜纸 显微镜 菌龄对革兰氏染色结果的影响 选取处于活跃生长期 指数生长期的菌体进行革兰氏染色 菌体尚未成熟或菌体过老 可能使染色结果呈现相反的结果 一 简单染色的步骤 见P11 1 涂片 取干净载玻片 火焰灼烧后 横放于玻片架上 在载玻片中央滴一小滴生理盐水 用接种环以无菌操作取少许菌体于水滴中 注 不要挑破培养基 混匀并涂成薄膜 注 涂片不易过厚 2 干燥 用夹子夹住载玻片一端 菌膜面朝上 反复通过火焰高处数次 烘干菌液 注 不能直接在火焰上烘烤 以免菌体变形 3 固定 用夹子夹住载玻片一端 迅速通过火焰2 3次 使菌体固定于载玻片上 4 染色 将玻片平放于玻片架上 加适量 以盖满菌膜为度 染液于涂片上 染色时间1 2min 5 水洗 倒去染液 用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗 切勿将菌膜冲掉 直至流下的水为无色为止 6 干燥 将玻片置于玻片架上 自然干燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残留水分 7 镜检 先用低倍镜找到视野后 再换油镜观察 四 实验步骤 二 革兰氏染色 见P12 1 涂片 固定 1 涂片 三区 涂片法 在载玻片的左端先加一滴蒸馏水 用无菌接种环挑取少量苏云金芽孢杆菌与左边水滴混合 将载玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央 在载玻片的右端加一滴蒸馏水 用无菌接种环挑取少量大肠杆菌与右边水滴混合 将玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央 三区 左区 苏云金芽孢杆菌区 中央区 两种菌的混合区 右区 大肠杆菌区 2 干燥及固定 步骤同简单染色法 涂片不易过厚 否则造成局部菌体脱色不完全 而使G 菌呈现革兰氏阳性结果 2 染色 1 初染 将玻片置于玻片架上 加适量 以覆盖菌膜为度 结晶紫染液染色1 2min 倾去染液 用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗 直至流下的水为无色 2 媒染 加卢戈氏碘液一滴 染色1min 水洗 3 脱色 将玻片倾斜 连续滴加95 乙醇脱色20 25s至流出液无色 立即水洗 4 复染 滴加蕃红复染2min后 立即水洗至流出液无色 5 干燥及镜检 将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干 先用低倍镜找到视野后 再换油镜观察 并判断菌体的革兰氏染色反应性 脱色时间对革兰氏染色结果的影响 脱色时间过短 G 菌转呈革兰氏阳性结果 如果脱色时间过长 G 菌转呈革兰氏阴性结果 媒染时间对革兰氏染色结果的影响 媒染时间过短 不利于结晶紫与细胞之间的结合 而使G 菌转呈革兰氏阴性结果 媒染时间过长 而使G 菌转呈革兰氏阳性结果 初染1 2min 媒染1min 脱色20 25s 复染2min 绘出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的形态图 并注明两菌的革兰氏染色的反应性 五 作业 大肠杆菌 10 100 枯草芽孢杆菌120 10 100 大肠杆菌 色 革兰氏 性菌 枯草芽孢杆菌120 色 革兰氏 性菌 六 思考与讨论 1 造成革兰氏染色结果不正确 假阳性或假阴性 的主要原因有哪些 2 如果某一细