转基因检测原理.doc

基于蛋白质的转基因产品检测方法1.酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA) ELISA是抗原抗体免疫反应和酶高效催化反应的有机结合，从20世纪70年代以来已在生物学领域广泛应用，该方法有两个特点，一是抗原抗体免疫反应在固体表面进行，二是用酶作为标记物进行蛋白质测定。 转基因植物表达的外源蛋白的抗体与被检测样品中的外源蛋白结合，再结合酶标抗体或酶标抗抗体，加入底物后通过酶促反应形成有色物质，根据颜色的深浅或酶标仪检测的结果判断是否为阳性。ELISA反应中，抗原抗体反应发生在固相微量滴定板上，抗原与抗体反应并产生稳定的复合物，经加入与酶连接的第二抗体可以显现，加入酶的底物后会产生颜色反应，因此可用分光光度计测量或肉眼检测(图3-1)。 ELISA方法有直接法、间接法和双抗夹心法，使用较多的是双抗夹心法，其检测灵敏度最高。一般的ELISA反应为定性检测，但若作出已知转基因成分含量与光密度值（OD）的标准曲线，也可根据标准曲线由未知样品的OD值来确定此样品中转基因成分的含量，达到半定量测定。一些ELISA试剂盒提供了标定物（已知浓度的液态目标分析物）和阴性对照（已知不含目标分析物）用于测试结果的显现和说明。这些标准品（标定物和对照）在给定的不同浓度（比如：0, 0.5 ppb, 1 ppb ,5 ppb ,10 ppb）显示不同的颜色。通过比较样品与标准品的颜色差别，就可以测定一定范围内样品的浓度，比如“1 ppb到5 ppb之间”。这种结果是半定量的。若要得到定量的解释，可以将微孔板放到微量板读数仪去读数，微量板读数仪可以一次性准确地读出所有样品和标准品的光密度。再利用读数仪所提供的软件，便可从标准曲线上计算出样品浓度。 ELISA具备了酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性，具有简便、快速、费用低等特点，但易出现本底过高的问题，且只能检测目的蛋白抗原性没有明显变化的粗加工产品。直接法和双抗夹心法都要制备特异的酶标抗体，制备方法较繁琐，且一种酶标抗体只能检测一种蛋白，而适用于间接法的酶标抗抗体已有商品出售。一种转基因蛋白的检测试剂盒是否能在表达相同外源蛋白的不同植物之间通用还要进行试验。2.侧向流动免疫测定法（Lateral Flow Strips) “侧流”型免疫测定是最近15年发展起来的，该方法之前主要用于医学领域。与ELISA相似，这种测定方法也是基于三明治夹心式技术原理，但该方法是在一种固相支持物上而不是在管子里进行，标记的抗原-抗体复合物侧向迁移，直至遇到在一种固定表面上的抗体。目前市场上已出现了用于侧向流动免疫测定并能用于野外测试的试剂盒。与DNA为基础的检测方法相比，该方法的样品处理简单。由于目标蛋白一般是水溶的且抗体具有高度专一性，因此检测样品仅需要初步处理便能达到测试的要求，具有快速、简便、适合野外操作等优点。 侧向流动免疫测定试纸条可用于检测叶片、种子和谷粒中的转基因成分。侧向流动试纸条被放入少量含有外源蛋白的植物组织抽提物中后，配对抗体与蛋白之间的发生结合形成了三明治形式的复合物，但并不是所有的抗体都与显色试剂相结合。由于膜上具有两个捕获区段，一个捕获外源蛋白结合物，另一个捕获显色试剂。当三明治形式和/或非反应的显色试剂在膜上的特异区段被捕获时，捕获区段显示微红色。若膜上显示单一的一条线（控制线），表明样本是阴性的，若出现两条线，表明样本是阳性的（图3-2）。 与ELISA相比，试纸条检测蛋白也是根据抗原抗体特异性结合的原理，不同之处是以硝化纤维代替聚苯乙烯反应板为固相载体。对外源蛋白特异结合的抗体上联结了显色剂，被固定在试纸条内，当试纸条一端被放入含有外源蛋白的植物组织提取液中，另一端吸水垫的毛细管作用使提取液向上流动，当特异抗体与外源蛋白相结合时，呈现颜色反应。试纸条上含有2个“捕获”区域：1个“捕获”结合外源蛋白的抗体蛋白复合物，另1个“捕获”显色剂。当所形成的夹心复合物及未反应的显色剂被试纸条上的相应“捕获”区捕获时，这些捕获区显红色区带。当在试纸条上只显示1条区带(质控线)时，为阴性结果，表明不含有被检测的转基因蛋白，而当显示2条带时则为阳性结果时则表明含有被检测的转基因蛋白。 美国检测StarLink玉米中的Cry9C蛋白的试纸条已成为美国官方的检测方法。Trait RUR Lateral Flow试剂条可用于检测整合在生物体内的源自根癌农杆菌CP4菌株的基因所表达的CP4-EPSPS蛋白。 侧向流动免疫测定试纸条是一种很快速简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，510分钟就可得出结果，不需要特殊仪器和熟练技能。但一种试纸条只能检测一种蛋白质，且只能检测有无存在外源蛋白而不能区分具体的转基因品种。侧向流动免疫测定方法是定性或是半定量。按照合适的采样步骤，可以在给定的一批样品中以99%的置信水平检测出少于0.15%的转基因成分。3.Western blot 杂交 在基因工程研究中, 经常需要检测外源基因是否能表达，即转录的mRNA能否翻译出特异蛋白质。外源基因表达产物若是酶，可测定该酶活性；若表达产物不具酶活性，就要采用免疫学方法检测，一般采用Western blot杂交。转化的外源基因正常表达时，转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，膜在高浓度的蛋白质（如牛血清白蛋白）溶液中温浴，以封闭非特异性位点。随后步骤同ELISA间接法，即加入目的蛋白的特异性抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的酶标记第二抗体, 最后通过第二抗体上标记化合物的性质进行检测。根据检测结果，可分析出被检植物细胞内目的蛋白表达与否、浓度大小、及大致的分子量。程英豪等以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）外壳蛋白（coat protein，CP）单克隆抗体, 采用Western blot杂交检测转CMV CP基因的番茄中外源基因的表达情况, 结果表明，在16株具有PCR扩增产物的转基因植株中有11株表达出CMV CP。 Western blot杂交是植物基因工程中检测外源基因是否表达出蛋白质的权威方法，将蛋白质的电泳、印迹、免疫测定融为一体，具有很高的灵敏性，可以从植物细胞总蛋白中检出50 ng的特异蛋白质，若是提纯的蛋白质，可检出15 ng。但其操作较繁琐，费用较高，不适于口岸快速、大量样品的检测。植物病毒检测方法之一为斑点免疫吸附法，与Western blot杂交相比不同的只是蛋白质样品不经过凝胶电泳，而是直接点在膜上，此方法很适合于大量样品的检测，是否也适用于转基因产品蛋白质的检测还有待试验验证。基于核酸的转基因产品检测方法 转基因产品的核酸检测方法主要有三种，一是核酸分子杂交技术（Southern blot），二是PCR检测技术，三是基因芯片技术。目前，PCR方法是最主要、最准确地检测转基因产品检测的方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法。目前基因芯片技术正处于发展阶段，应用于转基因产品检测还不多。一、按检测策略分类： 转基因产品PCR检测方法建立的主要依据是扩增特异性的转基因植物的外源基因片段，选择不同的特异性目的基因片段得到的PCR检测结果可能不太一致，因此建立一种转基因植物的PCR检测方法需要充分考虑扩增的特异性目的片段。在转基因植物过程中，外源DNA片段可以分为通用元件、目的基因、外源载体序列这三大类，因此根据不同的外源DNA片段，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测、品系特异性PCR检测。图4-1说明了四种转基因产品检测策略的重点和每种策略的灵敏度比较。表4-1列出了商业化转基因植物的主要外源基因。1.通用元件筛选 PCR(Screen PCR) 检测 通用元件筛选PCR检测主要以转基因产品的通用元件和标记基因为特异性扩增片段，例如 CaMV35S 启动子、 FMV35S 启动子、 NOS 终止子、 7S 3 终止子等通用元件以及 NptII 、 Hpt 、 Pat 、 GUS 、 aad 等标记基因。由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因产品的研究与生产中，从而大大降低了筛选PCR检测的特异性，只能用于转基因产品检测的初步筛选。目前常用的启动子、终止子和标记基因的PCR检测方法都已经建立起来，并用于转基因产品PCR检测。表4-2列出了主要转基因植物的筛选标记基因。2.基因特异性 PCR(Gene-specific PCR) 检测 基因特异性PCR检测以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段，例如 Cry1Ac 、 Cry1Ab 和 CP4-EPSPS 等基因，如图4-1所示。目前已经建立很多种外源目的基因的特异性PCR检测方法，基本上涵盖了所有商业化种植的转基因产品的外源目的基因。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表达，形成新的具有相同农艺性状的品系或新的转基因植物，因此基因特异性检测方法不能特异性的区分具有相同农艺性状的转基因植物及其品系，在建立基因特异性检测的同时还用引用其他PCR检测方法作为辅助。表4-3列出了转基因植物中的主要外源目的基因和已有的相关检测方法。3.构建特异性 PCR(Construct-specific PCR) 检测 构建特异性是通过检测外源插入载体中两个元件的连接区的DNA序列实现的，如图4-1所示。这种方法具有相对较高的特异性，在转基因产品检测种使用较多，目前商业化种植的各种转基因植物的构建特异性PCR检测方法已经基本上建立，尤其是用于食品原材料的转基因大豆、玉米、番茄、油菜和马铃薯等农作物。但是由于相同的转基因外源表达载体在转基因转化过程中，可能以一个、两个或者多个拷贝的形式插入到不同或者相同的植物基因组中，形成具有相同农艺性状的不同的转基因品系，因此构建特异性检测方法不能特异性的区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。4.品系特异性 PCR(Event-specific PCR) 检测 品系特异性检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，如图4-1所示。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。鉴于上述四种转基因产品检测策略的优缺点，品系特异性检测已经成为目前转基因产品检测研究的重点，并逐步地为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。到目前为止，已有相当部分的转基因植物品系的品系特异性检测方法的报道，例如转基因Roundup Ready大豆、转基因玉米品系（Mon810、NK603、T25、Bt11、Mon863、StarLink、GA21和Bt176）、转基因油菜GT73等。二、按PCR技术原理分类： 在转基因PCR检测过程中，由于不完全一致的检测原理和检测结果形式，PCR检测方法可以分为定性PCR检测、复合定性PCR检测、竞争性定量PCR检测、PCR-ELISA、荧光定量PCR检测等类型。1.定性PCR检测方法 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。主要过程是将提取的样品DNA作模板，以20 nt左右的寡核苷酸链作引物，引物能与外源基因DNA特定序列互补配对，通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的基因片段，使微量、特定的目标DNA片段在几个小时内迅速扩增到百万倍。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的特定核苷酸序列，因而具有快速、灵敏等优点。具体操作程序包括样品的DNA提取纯化、PCR扩增、扩增产物的检测。检测通常会设立空白对照（如无菌双蒸水）、阴性对照（非转基因样品DNA）或阳性对照（如载体质粒或转基因样品DNA）以保证检测结果的准确性。 PCR是一种快速、灵敏的核酸检测方法，灵敏度一般为0.01%。在转基因产品检测上已得到广泛应用。转基因产品检测过程中，一般是先检测样品的来源，通过检测常用植物的内标准基因实现，然后检测转基因产品中普遍存在的3种通用元件：启动子、终止子、标记基因。如果结果为阳性则进一步检测外源结构基因。目前我国已经形成了以定性PCR检测方法为主的转基因产品方法，并出台了相关行业和国家技术标准。 针对全球商业化转基因产品（大豆、油菜、玉米、棉花和番茄等）的定性PCR检测方法研究报道很多，且相应的转基因特异性检测试剂盒也已经研发成功。例如，通过对35S启动子、NOS终止子的检测，实现了对抗草甘膦大豆Roundup-Ready转基因成分的筛选检测。Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了14对引物检测7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计的引物特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。Vollenhofer等设计了针对35S启动子、NOS终止子、NPTII基因检测的特异性引物，利用PCR方法检测了转基因大豆Roundup-Ready、抗虫Bt玉米种子及深加工食品，并采用Southern blot杂交和限制性内切酶酶切对实验结果进行了确证。2.复合定性 PCR(multiplex PCR)检测 复合PCR检测，就是将两对或者两对以上的引物在同一个反应管中进行扩增，达到同时检测两个或两个以上目的DNA片段的目的。复合PCR检测的优点是PCR检测的效率高，实际检测时间短、费用低，且具有很高的检测灵敏度。复合PCR检测方法建立的难点在于PCR引物的设计和PCR反应条件的优化和每对引物反应效率不一致。因此在建立复合PCR检测体系时必须考虑上述因素。 目前，复合PCR检测方法已经在转基因产品检测中广泛应用，例如Delano等建立了转基因玉米(Bt 176, Bt11, Mon810和T14/25)、大豆(Roundup Ready)、油菜(GT73, HCN92/28, MS8/RF3和Oxy 235)的复合PCR检测方法，其检测灵敏度为0.1%。潘爱虎等报道了转基因油菜GT73的复合PCR检测。Germini等报道了在一个PCR反应中最多可以同时检测五种转基因植物品系（转基因玉米品系MON810、Bt11、Bt 176、GA21和转基因Roundup Ready大豆）的7个目的基因，且具有较高的检测灵敏度（0.060.25%）。3.巢式 PCR(Nested PCR) 巢式PCR，又称为套式引物（nested primer）PCR，有两对引物：一对引物在目的模板DNA的外侧，称为外引物（outer-primer）；另一对引物对应的序列在同一模板DNA的外引物的内侧，称为内引物（inner-primer），即外引物的扩增产物中含有内引物的互补序列，外引物扩增后的产物成为内引物的模板，这样经过两次PCR扩增可以大大地提高PCR检测的灵敏度，从而实现对微量模板DNA样品的分析和检测。同时，巢式PCR减少了引物非特异性褪火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率，也提高了检测的灵敏度。巢式PCR对转基因食品样品的快速检测非常有效。4.竞争性定量 PCR(QC-PCR) 检测 定量竞争PCR法的实验原理比较巧妙，实验程序设计较为严谨，采用构建的竞争DNA与样品DNA中相互竞争相同底物和引物，并根据电泳结果作出工作曲线图，从而得到可靠的定量分析结果，具体的反应原理见图4-2。1998年欧盟的12个实验室共同对竞争PCR法进行了研究，结果表明竞争PCR法与定性PCR法相比大大降低了实验室间的实验误差，竞争PCR法完全可以对转基因食品的转基因含量进行检测。此方法对实验仪器的要求不高，不足之处是需要利用基因重组技术构建标准竞争DNA，且每次检测需要作多个标准样品的对照，不太适合高通量的样品检测。 Hardegger等人建立了CaMV35s启动子和Nos终止子的竞争性定量PCR分析体系。Zimmermann等人利用该方法建立了转基因Bt11玉米的定量PCR分析体系。Van den Eede G等建立了转基因大豆、转基因玉米Bt176的定量分析。Studer E和Hardegger M等人成功利用该方法对转基因大豆、玉米的转基因含量进行了定量分析。5. PCRELISA检测 传统的PCR产物是利用琼脂糖凝胶电泳法分析，它只能粗略判断产物的大小，并不能鉴别产物的特异性，因此在常规PCR检测中常出现非特异性、假阳性等问题。新近发展起来的PCRELISA是用免疫学方法检测PCR产物，将PCR的高效性和ELISA的高特异性结合在一起。目前国外已开发出转基因产品PCRELISA检测试剂盒，我国也已建立了检测转基因产品的PCRELISA法。该方法用一种特殊的管（也可用PCR管代替）经过处理后共价交联结合诱捕分子，诱捕分子是与需扩增的目的DNA分子互补的一段寡聚核苷酸分子；以诱捕到的目标DNA为模板进行PCR扩增，其中大部分扩增DNA分子以共价键固定在管上，经变性去掉互补链，清洗后只有互补目标分子保留在管上，用生物素或地高辛标记的探针进行杂交，用碱性磷酸酯酶标记的抗生物素或抗地高